论文部分内容阅读
目的:研究人肝癌细胞HepG2内氧化还原状态变化对辐射敏感性的影响并探讨其作用机制。研究内容包括三方面:第一，研究天然抗氧化剂异甘草素对HepG2细胞氧化还原双向调控作用并揭示抗氧化剂发挥促氧化作用的机理;第二，研究扰乱肿瘤细胞氧化还原平衡、诱导氧化胁迫在辐射增敏中作用;第三，研究线粒体与NADPH氧化酶在辐射诱导肿瘤细胞死亡中的相互关系并确定辐照后引起氧化胁迫的活性氧主要来源。 材料和方法:利用荧光探针DCFH-DA和MitoSOX对细胞活性氧水平以及线粒体来源的O2·-进行检测;使用相应试剂盒对细胞内GSH/GSSG、CAT和T-AOC进行定量分析;激光共聚焦显微镜观察Keap-1、Nrf-2、8-OHdG、53BP1和γ-H2AX在细胞内分布以及数量;流式细胞仪检测辐射对p47phox亚基细胞膜转位、细胞周期分布以及凋亡的影响;实时细胞分析系统检测辐射后细胞存活及增殖;Westernblot方法检测辐射导致的Bax、Bcl-2、Nox2和Nrf-2表达水平的变化;采用EB长期处理方法建造线粒体缺失ρ0细胞，通过单细胞电泳和克隆实验评价ρ0与ρ+细胞对辐射敏感性的差别;分别利用Long-PCR技术和靶向性探针JC-1对线粒体DNA损伤以及膜电势丢失情况进行检测。 结果:1.10ug/mL异甘草素分别处理HepG2细胞0.5、1、2、6、12小时，结果显示在0～6小时内细胞内活性氧随时间变化逐渐降低、GSH/GSSG的比值逐渐增大，此时的细胞处于还原状态，异甘草素发挥抗氧化作用;而在6小时时间点上细胞内活性氧出现反弹性增多并高于初始水平、GSH/GSSG的比值也明显降低，此时细胞内发生氧化还原逆转，从还原状态进入氧化状态，抗氧化剂发挥了促氧化作用。通过对细胞内抗氧化系统检测发现，异甘草素处理HepG2细胞6小时后，细胞核内的Nrf-2蛋白被降到最低，被Nrf-2蛋白所调控的CAT以及T-AOC也被降到最低水平;而活性氧的产生酶(Nox2)表达量却被提升。 2.与单独4GyX-射线辐照组相比，10ug/mL异甘草素预处理HepG2细胞6小时后再给予4GyX-射线辐照，克隆形成率降低、细胞增殖曲线被抑制、Bcl-2/Bax表达量比值降低、肿瘤细胞的凋亡率明显提高。此外，10ug/mL异甘草素预处理HepG2细胞6小时后再给予4GyX-射线辐照，细胞内Nrf-2蛋白水平被降低、ROS的产生量增多、氧化损伤产物MDA含量增高，各项指标与单独4GyX-射线辐照组相比都有显著的统计学意义。 3.4Gy12C6+离子束辐照HepG2细胞引起大量p47phox亚基往细胞膜上转位，激活NADPH氧化酶。同时，导致严重的线粒体DNA损伤、线粒体来源的O2·-大量生成、线粒体内8-OHdG含量升高、膜电势降低、Cyt-C大量释放，最终导致肿瘤细胞凋亡;而当用NADPH氧化酶抑制剂APO预处理后再给辐照，线粒体各项损伤指标得到缓解，细胞凋亡数量也明显降低。单细胞电泳和克隆实验结果发现，4Gy12C6+离子束辐照对线粒体缺失的HepG2ρ0细胞的损伤远远小于正常的HepG2ρ+细胞。 结论:1.异甘草素对HepG2细胞具有氧化还原双向调控作用，氧化还原转化的时间点为6小时;2.异甘草素的促氧化作用与降低肿瘤细胞的抗氧化体系、增强活性氧产生能力有关;3.异甘草素诱导氧化胁迫提高HepG2细胞辐射敏感性; 4.在重离子辐射诱导HepG2细胞死亡过程中，NADPH氧化酶活化产生的ROS是线粒体进入恶性循环损伤的诱导因素，而线粒体产生的ROS则是辐照后持续氧化胁迫的根源，线粒体损伤在HepG2细胞死亡中起到了至关重要的作用。