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[背景]类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种原因不明的慢性多系统疾病,以对称性地累积外周关节的持续性滑膜炎为特征性表现。滑膜炎症可导致软骨破坏和骨质侵蚀,而最终影响关节的完整性是RA的标志。目前其病因及发病机制尚未完全阐明,临床治疗缺乏明确有效的作用靶点,这也给RA的治疗带来极大的困难。导师林昌松教授在继承国家级名老中医陈纪藩教授学术经验基础上,利用药对配伍方法对临床治疗RA有显著疗效的昆明山海棠(THH),开展了昆明山海棠配伍续断(昆断汤,KD)和昆明山海棠配伍益母草(昆母汤,KM)的系列研究,结合大量临床实践,研制出治疗RA的经验方——断藤益母汤(昆明山海棠配伍续断、益母草,KDM)。前期临床研究表明：断藤益母汤治疗RA有确切疗效；实验研究证实：断藤益母汤能显著下调TNF-α、Toll样受体4的表达,抑制人RA滑膜成纤维细胞的增殖；上调bax/bcl-2比值、caspase-3的表达,以促进人RA滑膜成纤维细胞的凋亡。为进一步探讨断藤益母汤对RA的骨质破坏的影响,本实验依托国家自然科学基金资助项目(No.81173634)和广东省自然科学基金资助项目(No.2014A030313403)进行设计。[目的]通过本研究,希望能够明确断藤益母汤对RA骨代谢影响的确切作用,重点探讨RANKL/OPG信号通路和Wnt/β-catenin信号通路在RA骨代谢中的作用机制和断藤益母汤的作用机理,为其临床应用提供理论依据。[方法]1.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠的治疗作用实验分组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照,以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。处理方法：应用经典的RA模型——胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型,各干预组在CIA大鼠模型加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算,KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d;MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w;Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次,其余组每天灌胃1次,连续4周。观测指标：大鼠一般情况观察,如体毛、活动、饮食、排泄等,体重变化,关节炎指数(Arthritis index,AI)评分,大鼠左、右后足爪容积；HE染色法观察大鼠左侧踝关节滑膜、软骨的病理学改变情况；ELISA法测量大鼠血清TNF-a浓度。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示,采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。2.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠骨密度、骨小梁分析的影响实验分组：空白对照组(Control),模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照,以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为4只。处理方法：应用CIA大鼠模型,各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算,KDM, KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d;MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w;Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次,其余组每天灌胃1次,连续4周。观测指标：Micro-CT影像学评价；骨骼矿物质参数指标：骨矿物质含量(bone mineral content,BMC)、骨矿物质密度(bone mineral density,BMD);体视学测量参数指标：骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th),骨表面积／体积(bone surface area/bone volume,BS/BV)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb. Sp);结构模型指数参数指标：骨小梁模式因子(trabecular pattern factor,Tb.Pf)、结构模型指数(structure model index,SMI)。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示,采用one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。3.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠破骨细胞、成骨细胞的影响实验分组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照,以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。处理方法：应用CIA大鼠模型,各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算,KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d;MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次,其余组每天灌胃1次,连续4周。观测指标：抗酒石酸酸性磷酸酶及碱性磷酸酶(TRACP&ALP)双重染色法观测大鼠踝关节破骨细胞(osteoclast,OC)和成骨细胞(osteoblast,OB)的数量；ELISA法检测大鼠血清OC标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和OB标志物骨碱性磷酸酶(BALP)的浓度。数据分析：数据采用SPSS 17.0进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示,采用one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。4.断藤益母汤及其组方药物对RANKL/OPG信号通路的调节作用实验分组：空白对照组(Control).模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照,以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。处理方法：应用CIA大鼠模型,各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算,KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w;Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次,其余组每天灌胃1次,连续4周。观测指标：免疫组化法(IHC)观测大鼠踝关节RANKL、OPG的蛋白表达量；ELISA法检测大鼠血清RANKL、OPG的浓度。数据分析：数据采用SPSS17.0进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示,采用one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。5.断藤益母汤及其组方药物对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用实验分组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照,以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为4只。处理方法：应用CIA大鼠模型,各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算,KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d;MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w;Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次,其余组每天灌胃1次,连续4周。观测指标：QPCR法检测大鼠踝关节Wnt3a、β-catenin、Dickkopf-1的mRNA的表达。数据分析：数据采用SPSS 17.0进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示,采用one-way ANOVA进行统计分析,组间两两比较方差齐性时选用LSD检验,方差不齐时选用Tamhane T2法,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠的治疗作用大鼠一般情况、体重变化情况：与Control组比较,Model组、各干预组大鼠精神倦怠、活动受限、皮毛色灰暗欠光泽；体重增长缓慢有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较,KDM组、KD组、KM组体重增长改善有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KM组体重增长改善有统计学意义(P<0.05)。大鼠足肿胀程度：与Model组比较,KDM组、KD组、KM组AI评分改善有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组AI评分改善无统计学意义(P>0.05)。与Model组比较,各干预组左、右足体积改善有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组左、右足体积改善有统计学意义(P<0.05)。大鼠踝关节病理学评分：与Model组比较,KDM组、KM组滑膜病理评分降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组滑膜病理评分差异无统计学意义(P>0.05)。与Model组比较,KDM组、KD组软骨病理评分降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组软骨病理评分差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠血清TNF-α浓度：与Model组比较,MTX组、KDM组、KD组、KM组血清TNF-α浓度降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KM组血清TNF-α浓度降低有统计学意义(P<0.05)。2.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠骨密度、骨小梁分析的影响骨骼矿物质参数指标：与Model组比较,MTX组、KDM组、KD组、KM组踝关节骨矿物质含量(bone mineral content, BMC)升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组踝关节BMC升高无统计学意义(P>0.05)。与Model组比较,KDM组、KD组踝关节骨矿物质密度(bone mineral density,BMD)升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组踝关节BMD升高无统计学意义(P>0.05)。体视学测量参数指标：与Model组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组踝关节BV/TV升高有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组踝关节Tb.N升高有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,KDM组踝关节骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组踝关节Tb.Th升高有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,KDM组踝关节骨表面积／体积(bone surface area/bone volume, BS/BV)降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,各中药组BS/BV降低无统计学意义(P>0.05)。与Model组比较,各干预组踝关节骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组踝关节Tb.Sp降低有统计学意义(P<0.05)。结构模型指数参数指标：与Model组比较,各干预组踝关节骨小梁模式因子(trabecular pattern factor,Tb.Pf)降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组踝关节Tb.Pf降低有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,各干预组踝关节结构模型指数(structure model index,SMI)降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节SMI降低有统计学意义(P<0.05)。3.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠破骨细胞、成骨细胞的影响破骨细胞数量及功能：与Model组比较,各干预组踝关节OC细胞数量降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节OC细胞数量降低有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,MTX组、KDM组、KD组、KM组血清TRACP 5b浓度降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组血清TRACP 5b浓度降低有统计学意义(P<0.05)。成骨细胞数量及功能：与Model组比较,各干预组踝关节OB细胞数量增多有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节OB细胞数量增多有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,KDM组、KD组血清BALP浓度升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组血清BALP浓度升高有统计学意义(P<0.05)。4.断藤益母汤及其组方药物对RANKL/OPG信号通路的调节作用RANKL蛋白：与Model组比较,各干预组踝关节RANKL蛋白表达降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组踝关节RANKL蛋白表达降低有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,MTX组、KDM组、KD组、KM组血清RANKL浓度降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组血清RANKL浓度降低有统计学意义(P<0.05)。0PG蛋白：与Model组比较,各干预组踝关节OPG蛋白表达升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组踝关节OPG蛋白表达升高有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,各干预组血清OPG浓度升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组血清OPG浓度升高有统计学意义(P<0.05)。5.断藤益母汤及其组方药物对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用Wnt3a的mRNA表达：与Model组比较,MTX组、KDM组、KD组、KM组踝关节Wnt3a的mRNA表达升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节Wnt3a的mRNA表达升高有统计学意义(P<0.05)。β-catenin的mRNA表达：与Model组比较,THH组、KDM组、KD组、KM组踝关节β-catenin的mRNA表达升高有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组、KD组、KM组踝关节β-catenin的mRNA表达升高有统计学意义(P<0.05)。Dickkopf-1的mRNA表达：与Model组比较,各干预组踝关节Dickkopf-1的mRNA表达降低有统计学意义(P<0.05)；与MTX组比较,KDM组踝关节Dickkopf-1的mRNA表达降低有统计学意义(P<0.05)。[结论]断藤益母汤、昆断汤、昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤均能不同程度改善CIA大鼠的骨侵蚀情况,其中断藤益母汤组在抑制炎症指标和促进骨保护方面均优于昆断汤、昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组；昆断汤在促进骨保护方面优于昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组；昆母汤在抑制炎症指标方面优于昆断汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组。断藤益母汤能降低CIA大鼠踝关节中RANKL的表达、升高OPG的表达,抑制RANKL/OPG信号通路对破骨细胞的分化、成熟,抑制骨吸收；同时能升高CIA大鼠踝关节中Wnt3a、β-catenin的mRNA表达、降低Dickkopf-1的mRNA表达,激活Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的分化、成熟,促进骨形成。使得失衡的破骨细胞主导的骨吸收和成骨细胞主导的骨形成恢复到相对平衡的状态。