论文部分内容阅读
香蕉枯萎病是由尖镰孢古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）侵染香蕉引起的维管束病害，近年来4号生理小种的迅速传播对世界香蕉生产构成了极大的威胁，从分子水平上揭示该病原菌的致病机理，将为开拓新的防治途径和选育抗病品种提供理论基础，也为尖镰孢的功能基因组学研究积累材料。
本研究在已经构建的香蕉枯萎病菌4号生理小种(FOC4)外源T-DNA插入突变体库中选取43个突变体菌株，通过致病力测定和表型研究，筛选得到致病力减弱或表型发生变异的9个突变体，编号分别为L1186、L39、L715、L953、X1071、X3617、X4138、X4394、X4420。Southern杂交结果表明，除了X4138为T-DNA双拷贝插入突变体外，其余8个均为T-DNA单拷贝插入。
采用TAIL-PCR和LA-PCR技术对8个单拷贝插入突变体进行基因克隆，获得5个突变体(L39、L715、L953、X1071、X4420)的T-DNA插入突变基因全长序列和3个突变体(L1186、X3617、X4394)的T-DNA侧翼序列，经生物信息学分析，同时结合致病力测定和表型试验，获得如下结果：
fo-CWDE编码蛋白与玉蜀黍赤霉Gibberella zeae Petch PH-1和红球丛赤壳Nectria haematococca mpVI 77-13-4假设蛋白具有高度同源性。通过突变体L715的致病力测定和表型分析，推断fo-CWDE与FOC4的两种胞外细胞壁降解酶CWDE（多聚半乳糖醛酸酶Peh和果胶酸裂解酶Pel）活性相关，进而影响菌株在香蕉中致病力。
fo-Acs/Faa编码的蛋白与G.zeae Petch PH-1的酰基辅酶A合成酶(Acs)具有81％的同源性，通过对突变体L953的表型分析和致病力测定，推断该基因在FOC4中的功能可能是保持细胞壁完整性并维持正常渗透压，若其发生突变将导致包括菌落性状、生长量、疏水性和产孢量在内的多方面表型发生变异，并使得病原菌丧失致病性和定殖能力。
fp-SP编码的蛋白含有跨膜转运蛋白超家族MFS保守结构域，并与黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum的SP转运蛋白（MFS中最大的蛋白家族）具有54％的同源性，fo-SP对FOC4产孢量、香蕉假茎中的侵入和定殖能力、胞外纤维素酶Cel活性产生重要影响。
fo-L39的编码蛋白与G.zeae Petch PH-1假设蛋白具有87％的同源性，该假设蛋白功能未知。通过表型测定，推断基因fo-L39的功能是参与跨膜转运蛋白的合成或转运过程，该基因发生突变将影响FOC4的孢子形成，从而最终导致致病力的丧失。
fo-PAl/Rf编码的蛋白与G.zeae Petch PH-1的PAl和Rf蛋白结构具有79％的同源性，序列分析表明T-DNA的插入位点在该基因启动子上游位置，从而影响其表达，造成FOC4的产孢量、Cel活性降低，更具体的分析还有待进一步做RT-PCR和功能互补进行验证。
fo-MED14基因部分序列编码肽段与G.zeae Petch PH-1的MED14蛋白相应片段具有67-74％相似性，突变体Ll186的表型分析和致病力测定结果表明，该基因在FOC4中的功能可能是参与孢子的形成和Cel的合成，若其发生突变将导致致病力的丧失。
fo-GMA12/MNN10部分序列编码肽段与G.zeae Petch PH-1的半乳糖转移酶GMA12/MNN10假设蛋白相应片段具有91-92％的相似性，表型分析推断其发生突变将使得FOC4中的糖基转移酶合成受限，从而降低其对养分的利用能力和产孢能力，导致致病力丧失。
本研究还通过ATMT技术对突变体L715进行fo-CWDE基因的互补转化，互补转化子的胞外Peh和Pel酶活、致病力得到了恢复，进一步验证了该基因与FOC4的CWDE酶活相关，在致病过程中起着重要作用。