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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一种工业常用的淀粉脱支酶,能选择性水解普鲁兰糖、支链淀粉、极限糊精中的α-1,6糖苷键,是淀粉脱支水解的关键限速酶,属于α-淀粉酶家族。淀粉加工中,普鲁兰酶通常与其他淀粉酶如糖化酶、β-淀粉酶复配使用,增加淀粉糖化反应速率,获得高纯度的葡萄糖、麦芽糖等小分子糖浆。目前关于普鲁兰酶的研究主要存在2个方面问题:一是自然界中大多数普鲁兰酶的催化效率和热稳定性差,难以在淀粉加工的高温过程中高效地发挥水解作用;二是野生型菌株的普鲁兰酶产量普遍偏低,分泌效率差,难以满足工业生产对普鲁兰酶的大量需求。本论文针对上述普鲁兰酶研究中存在的问题,首次克隆表达了来源于深海超嗜热嗜压古菌Pyrococcus yayanosii CH1的普鲁兰酶Pul PY,通过结构域切除提高了其催化效率和热稳定性。之后通过酶分子三维结构分析和半理性设计策略,提高了来源于Anoxybacillus sp.WB42普鲁兰酶PulA的催化效率和热稳定性,同时在枯草芽孢杆菌中建立了普鲁兰酶高效分泌表达系统。主要研究结果如下:（1）超嗜热嗜压古菌P.yayanosii CH1普鲁兰酶PulPY在大肠杆菌中成功表达并进行了酶学性质表征。在PulPY的N端分别融合多种蛋白标签,PulPY在大肠杆菌中成功表达,其中融合sumo标签时Pul PY表达量和酶活最高。酶学性质分析显示,PulPY最适温度为95℃,100℃保温4 h还有50%酶活;最适p H为6.6,在p H 5.8-8.0条件下处理4 h剩余酶活大于80%。动力学分析显示,PulPY在以普鲁兰多糖为底物时比酶活为5.37 U·mg-1,Km=8.78 mg·mL-1,kcat=12.33 s-1,kcat/Km=1.43 mL·mg-1·s-1。Fe2+、Co2+、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇对PulPY酶活有显著激活作用,其中二硫苏糖醇使PulPY酶活提升至原来的3.4倍。底物特异性和水解产物分析显示,PulPY属于Ⅱ型普鲁兰酶。（2）基于结构解析通过分子改造进一步提高了PulPY的活性和热稳定性。基于NCBI蛋白保守结构域分析工具对PulPY结构域位置和功能的解析,构建了3个截短突变体（△28N、△791C和△28N+△791C）。其中组合截短突变体△28N+△791C的最适温度为100℃,较野生型PulPY提高5℃,100℃保温后剩余酶活也有一定提高;最适pH为6.4,较重组PulPY向酸性偏移,pH5.8-8.0环境中处理4 h剩余酶活与原酶相当。动力学分析显示,△28N+△791C在以普鲁兰多糖为底物时的比酶活值为32.18 U·mg-1,Km=6.63 mg·mL-1,kcat=54.16 s-1,kcat/Km=8.25 mL·mg-1·s-1,底物亲和力和催化效率分别是原酶的1.3和5.8倍。圆二色谱分析发现,与原酶相比,△28N+△791C中无规结构的含量降低6.4%,α-螺旋数量提升6.2%,整体二级结构更加精简和紧凑,无规结构含量的降低可能是其催化效率和热稳定性显著提高的重要原因。（3）基于半理性改造策略提高了来源于Anoxybacillus sp.WB42的普鲁兰酶PulA的活性和热稳定性。对PulA分子结构进行建模分析,结合表面氨基酸突变和二硫键设计策略,构建了一个包含26个突变体的小而精的突变库,从中成功筛选出1个催化效率和热稳定性提高的迭代组合突变体PulAC。酶学性质分析显示,PulAC最适温度为65℃,67℃保温30 min剩余85%的活力,高于PulA（50%）;最适pH为6.2,较PulA向酸性偏移,pH 6.6-7.8环境下处理4 h剩余酶活大于90%,高于PulA（60%）;熔融温度Tm值为80.2℃,较PulA提升2.1℃。动力学分析显示,PulAC在以普鲁兰多糖为底物时的比酶活值为98.2 U·mg-1,kcat=134.7 s-1,kcat/Km=12.22m L·mg-1·s-1,是PulA的1.5倍。通过比较PulAC与PulA的分子结构差异,发现PulAC的Arg419与Asp416之间可能形成1个氢键,Cys 245和Cys 326、Cys 651和Cys 707之间可能分别形成1个二硫键。次级键的形成更有利于底物的运输和与普鲁兰酶（β/α）8-桶状催化结构域的结合,是PulAC较Pul A催化效率和热稳定性提升的重要原因。（4）在枯草芽孢杆菌中构建了普鲁兰酶高效表达系统,实现了Pul AC的高效分泌表达。以具有良好热稳定性和高催化效率的Anoxybacillus sp.WB42突变体普鲁兰酶pulAC为报告基因,通过对质粒骨架、启动子、核糖体结合位点的优化,在枯草芽孢杆菌中构建了普鲁兰酶高效表达系统。重组菌B.subtilis WB800/RBS7在250 m L摇瓶中胞外普鲁兰酶产量可以达到154.9U/m L,是表达元件优化前的136.8倍;5-L发酵罐中小试培养,发酵液中普鲁兰酶产量最高为269.1 U/mL,是摇瓶水平的1.7倍,在Ⅱ型普鲁兰酶小罐发酵生产的研究报道中产量最高。