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脑型疟是由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,Pf)感染所引起的最严重的致死性并发症，目前尚无有效的防治手段。研究发现，脑型疟的发病与Pf感染红细胞(Parasitized red blood cell,PRBC)与血管内皮细胞的粘附密切相关。大量PRBC粘附于脑毛细血管中可引起脑微血管阻塞，进而使Pf与外周循环隔离而导致了免疫逃避。如果能阻断这种粘附作用，则PRBC就可随血流进入循环并被免疫系统清除，从而抑制Pf在宿主体内的生长和繁殖，达到预防和治疗脑型疟的目的。PRBC与血管内皮细胞的粘附是由PRBC上的粘附蛋白与血管内皮细胞受体间的结合来介导的，多种血管内皮细胞受体如CD36、ICAM-1、TSP、CSA等可介导这一粘附作用，其中ICAM-1对脑型疟具有特异性。大量研究已经证实了ICAM-1与PRBC间的体内外结合作用，因此，研究ICAM-1与PRBC间相互作用的分子机制，将为研制抗脑型疟粘附阻断剂奠定良好基础。Berent和Okenhouse同时报道ICAM-1与PRBC的结合位点位于其功能域1区(Domain 1)，与ICAM-1同LFA-1间的结合位点部分同源但又有所不同。但对于ICAM-1结合点的确切位置目前尚不清楚。 本研究以能同时阻断ICAM-1与LFA-1及PRBC结合的抗ICAM-1Domain 1单抗15.2为靶，采用亲和筛选法对噬菌体随机12肽库进行三轮筛选，通过ELISA、竞争抑制试验、Dot-ELISA及Western blot等方法鉴定，获得与15.2抗体具有结合特性的噬菌体短肽。对阳性克隆进行DNA序列分析，推导其12肽的氨基酸序列并与ICAM-1氨基酸全序列进行了同源性比较。合成了其中一个与ICAM-1同源性最好的12肽KLYLIAEGSVAA，并用ELISA、竞争性ELISA等进行了特异性、亲和力鉴定。通过玻片免疫组化试验及粘附抑制试验等鉴定了阳性噬菌体展示肽与LFA-1及PRBC作用的生物学活性。以噬菌体展示肽 郝文波：噬菌体肽库技术筛选特异阻断恶性疟原虫感染红细胞粘附短肽的研究KLYLIAEGSVAA为靶从噬菌体随机环7肽库中筛选其对应序列，以进行分子间相互作用的结构分析。 结果显示，以单抗 15．2为靶对噬菌体随机十二肽库进行三轮“吸附一洗脱一扩增”亲和筛选后，根据回收率及ELISA检测结果，结合噬菌体得到良好富集，第三轮淘洗的产率较第一轮高出约 1000倍。从第三轮洗脱液铺制的琼脂板中随机挑取30个噬菌体单克隆，ELISA检测有26个A405＿值高于无关抗体对照和阴性对照ZI倍以上，定为阳性克隆，阳性率达86．7O。 按试剂盒中方法快速提取ELISA阳性的26株噬菌体单链DNA，DNA测序后推导其所编码的氨基酸序列，共得到6种短肽，相应的展示肽序列为 KLYLIAEGSVAA、HSSHTSNTLPSV、HPPKLLESMQRS。IEVPFLKKHYTL、LPLSLRPNTTPF及 SSMTHQHARVDT，其中有 18个阳性噬菌体克隆表达 12肽 KLYLIAEGSVAA。将该短肽与 ICAMl的氨基酸序列进行同源性比较，发现短肽中的K（XX）L（XXX）GSV与 ICAM－l的 8l 7位 aa有 50％的同源性。 从6种不同序列短肽中各挑取一个克隆进行扩增，取 IXIO丫fu进行DotELISA及Western blot试验，以进一步鉴定6种展示肽的结合特性。结果除表达序列为HSSHTSNTLPSV的克隆外，其余5个克隆均可被 15．2 单抗特异性识别，其中以 HSSHTSNTLPSV及HPPKLLESMQRS克隆的反应最强。 对6种不同序列的噬菌体展示短肽进行竞争抑制试验，观察ICAM－l分子能否竞争抑制阳性克隆与15二抗体的结合，以进一步鉴定阳性克隆的特异性。结果 ICAM－l分于不同程度地抑制了 15．二抗体与阳性克隆的结合，抑制效果最好的噬菌体克隆抑制率高达99％以上。反之，阳性噬菌体（克隆 18及 22）也可以竟争性抑制 ICAM4分于与 15．2抗体之间的结合，抑制程度随噬菌体浓度的升高而增加，而野生型M13则不具有相应的抑制作用。进一步表明获得的阳性噬菌体展示肽能很好地模拟ICAM－l的抗原表位。 化学合成了同源性最高的KLYLIAEGSVAA短肽，通过ELISA、竟争抑制试验鉴定了合成肽的抗原性。结果合成肽ESA偶联物可与15．2抗体特异性结合，合成肽可竞争性抑制 15．2抗体与 ICAM－l分子及相应阳性噬菌体克隆的结合，提示KLYLIAEGSVAA合成肽具有ICAMl的抗原性。 －5－ 第一军医大学博上学位论文 分别以白细胞及 PRBC涂片，以阳性噬菌体克隆 18及 22进行玻片免疫组化试验，结果阳性噬菌体 18及 22均可与白细胞发生特异性结合，DAB显色出现棕黄色颜色反应，加入ICAM－l分子后该结合作用可被阻断。但在PRBC玻片兔疫组化中，未发现阳性克隆与PRBC结合。以ICAM－l分子、阳性噬菌体及合成肽包被培养皿，加入传代培养的PRBC进行粘附实验，也未见噬菌体与PRBC结合，因阳性对照ICAM＊分子也未出现阳性反应，推测该株PRBC冻存多年，连续传代培养后己经失去了与ICAM．l的粘附特性，不能作为粘附试验的模型。 以表达同源性最好的12肽KLYLIAEGSVAA的噬菌体为靶对噬菌体随机环 7肽库进行三轮“筛选一扩增一富集”，每轮先用野生