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随着石油、煤炭等化石燃料的日益枯竭以及由此带来的石油液体燃料等价格不断攀升,人们将目光转向可再生能源。基于木质纤维素为原料的第二代燃料乙醇,因其以农业废弃物为原料,避免了第一代燃料乙醇以粮食为原料与人“争食”的境地,迅速得以发展。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因具有高糖、高乙醇耐受能力,高乙醇发酵能力而受到人们青睐,成为燃料乙醇发酵的首选菌株。然而天然酵母仅能够利用己糖发酵,而不能利用在农业废弃物含量仅次于葡萄糖的木糖(Galbe and Zacchi 2007)。因此葡萄糖和木糖的共利用对第二代燃料乙醇的经济适用性至关重要。课题组前期在酿酒酵母中引入了具有自主知识产权的来源于牛瘤胃宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA,该基因及蛋白已获得美国专利授权(US 8586336 B2),且在酵母中获得了较高的活性;在此基础上,课题组超表达木酮糖激酶和疏通非氧化型磷酸戊糖途径增加流向木糖代谢途径的流量;敲除GRE3基因减少木糖向木糖醇非特异性的转化,使菌株获得了利用木糖的能力,但利用能力依然较差。在此基础上,构建呼吸敲除菌,消除呼吸作用对乙醇积累的影响。然而,呼吸代谢阻断后,菌株不能在木糖上生长。因此,课题组在此基础上,在木糖为唯一碳源的培养基中对菌株进行适应性驯化,使木糖代谢能力显著提高。利用转录组学分析,得到了一些可能影响木糖代谢及乙醇得率的基因,但驯化菌株木糖代谢能力增强的机理并未揭示。本论文在前期工作的基础上,通过基因组测序,以及相关基因的功能分析揭示驯化菌株木糖代谢能力显著提升的具体机制。1)驯化前后菌株木糖异构酶活性及基因转录水平的测定我们发现,驯化后菌株木糖异构酶活性比驯化前提高了 1倍。而实验结果表明驯化前后菌木糖异构酶基因xylA序列、质粒拷贝数没有发生变化。因此我们测定了该基因的转录水平,发现驯化后菌株中转录水平为驯化前的1.5倍。为验证该酶活的提高是否具有普遍性,我们引入树干毕赤酵母来源的木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2,或低等真菌Piromyces sp.来源的Pi-xylA,发现其表达活性都有不同程度的提高。但是利用相同的质粒表达报告基因lacZ,并测定其酶活,并未发现酶活提高现象。这表明驯化后菌株增强木糖代谢能力可能是由Ⅺ的酶活提高所引起的。2)驯化前后菌株基因组测序及比较分析对驯化后菌株进行基因组重测序,测序原始数据与驯化前参照基因组比对发现,驯化菌株中有117个SNPs属于非同义突变,导致66个基因发生氨基酸改变。存在738个short InDels,影响42个基因。除去非编码区突变、同义突变以及53个没有注释的基因,并对剩余基因PCR重测序,发现12个基因发生突变。3)影响木糖代谢的突变基因的筛选随后这些突变基因木糖平板生长实验表明,大部分的突变基因并没有对木糖生长起到积极的影响,但是转录因子ask10△和ask10△+ASK10M475R较对照菌和突变体超表达菌ASK10M475R在木糖平板生长表现出明显优势。4)Ask10p功能研究为了验证点突变ASK10M475R对基因功能完整性的影响,我们进行氧化胁迫实验,结果表明对ASK10基因在基因组上原位突变M475R,使得菌株在含H202平板上生长受到影响,而ASK10缺失并未使生长严重受损,表明突变体可能使ASK10完整功能受到损害。接着我们观察ASK10点突变和缺失对木糖液体发酵生长的影响,结果表明该基因缺失和突变均能显著促进木糖生长,进一步酶活和转录水平测试发现,原位突变菌ASK10M475R,缺失菌ask10△和ask10△+ASK10M475R，Ⅺ酶活和转录水平较其他菌株有两倍以上提高。这表明ASK10的缺失和突变会提高Ⅺ的转录和酶活水平。对上述改造菌株转录组分析发现与野生型ASK10wt相比,ask10△和ASK10M475R有关负责蛋白正确折叠的分子伴侣共同发生明显的上调。综上所述,通过对驯化前后菌株中木糖异构酶酶活及其基因的转录水平的分析,我们发现驯化后菌株木糖异构酶活性提高是影响木糖代谢的关键因素之一。通过基因组测序,突变基因功能分析,我们发现转录因子Ask10p的缺失或者点突变Ask1OM475Rp可以提高木糖异构酶酶活。后续研究工作将围绕Ask1Op如何调控木糖异构酶的活性来展开。