应用于肿瘤临床治疗的人源化R5和Robo-Fc表达质粒的构建

• 作 者: 余君铭
• 机 构: 中国科学院上海生命科学研究院
• 出 处: 中国科学院上海生命科学研究院
• 发表日期: 2005年期
• 关键词: 抗体基因克隆 人源化 表达载体构建 抑制肿瘤生长 抗体基因

Slit2是一种由中线细胞和内皮细胞分泌的神经迁移因子，我们实验室发现很多肿瘤细胞上都有Slit2的表达[1]。Robo1(Roundabout1)是Slit2的受体，由内皮细胞表达横跨在细胞膜上。胞内区含有四个确认为同类的结构域，胞外区是由5个Ig样功能区和3个FN样功能区(FibronectintypeⅢ)。胞外区的Ig结构域和Slit2的相互作用有关(Chenetal.，2001)。Slit2和Robo两者相互作用，除了可以影响神经轴突的分叉和转向[2，3，4]以及神经元细胞的迁移[5]外，还可以影响血管内皮细胞的运动，吸引内皮细胞到肿瘤组织周边的血管。血管通过出芽延伸到肿瘤内，为肿瘤的快速生长提供养分[1]。
我们实验室实验显示，Robo1的单抗R5可以有效地阻断Slit2和Robo1的相互作用，从而抑制新生血管的形成，切断旺盛生长的肿瘤细胞的养分供应，达到抑制肿瘤生长的目的[1]。这便是“饥饿疗法”治疗肿瘤的理论依据。
为了更好的研究R5的抗肿瘤生长活性并开发其在临床治疗上的应用，我们在已制备了能分泌R5单抗的杂交瘤细胞株的基础上，利用RT-PCR克隆了小鼠来源的R5抗体轻重链基因，分别构建在真核表达载体上并共转HEK293T细胞表达，用ELISA和pull-down检测到重组R5的表达。并细分了抗体基因的功能结构域，鉴定出其CDR序列。在此基础上，采用CDR-grafting的策略人源化小鼠R5单抗基因，并克隆到昆虫杆状病毒表达载体pAc-k-CH3上，为下一步在昆虫细胞中的表达和进一步开发应用于临床的人源化R5抗体奠定了基础。
另外，考虑到阻断Slit2-Robo1之间的相互作用对抑制肿瘤生长的重要作用，我们利用常规分子生物学操作连接了人Robo1的胞外片段和人Fc片段，并克隆到载体p3CI-dhfr上。包含了第一个IgG结构域的Robo1胞外区可以和Slit2结合，竞争结合了肿瘤细胞分泌的Slit2分子，使得内皮细胞膜上的Robo1无法和Slit2结合，导致血管生长的抑制进而抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。