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肝癌是全球第五大肿瘤疾病,具有极高的发病率及致死率。目前虽然在临床上主要采取化学疗法、切除法、肝移植、免疫疗法等多种方法治疗肝癌,但是在发达国家,肝癌疾病的生存率仅为3-5%,这促使人们不得不继续寻找新的治疗肝癌疾病的方法。双环醇(4,4’-二甲氧基-5,6,5’,6’-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2’-甲氧羰基联苯)为抗肝炎化学合成新药,在临床上已被广泛应用于治疗HBV感染。此外,一些研究证明双环醇还具有提高肝功能、保护肝脏免受化学物毒害的作用；同时也有研究发现双环醇可以诱导肝癌细胞中热休克蛋白HSP27/70的表达,从而抑制细胞线粒体途径的凋亡。但是,对双环醇的抗肿瘤效果以及双环醇在肿瘤细胞周期与自噬方面功能的研究仍少有涉及,而相关文献中对双环醇作用后的癌细胞进行高通量筛选差异表达基因等初步研究表明双环醇具有作为抗癌药物的潜能。因此本研究重点探索了双环醇对HepG2细胞的毒性作用,并且在体外和体内环境探究了双环醇对肝癌细胞作用的分子机制。结果如下：1.双环醇显著抑制HepG2细胞增殖,而对正常肝细胞LO2的毒性很低。MTT实验表明,双环醇对HepG2的IC50值为LO2细胞的三分之一。而通过流式细胞术研究发现,双环醇对HepG2细胞活性的抑制作用主要源于其能够抑制细胞周期以及诱导细胞产生自噬,而在双环醇作用下的HepG2的凋亡水平没有发生变化。在细胞周期方面,双环醇能够诱导HepG2细胞发生时间和浓度梯度依赖的G1期细胞阻滞。在细胞自噬方面,经过双环醇处理后,细胞内自噬标志蛋白LC3Ⅰ向LC3 Ⅱ转化。另外,通过荧光显微镜对GFP-RFP-LC3转染细胞的观察和透射电镜直接观察显示,细胞内自噬小体和自噬溶酶体的数量在双环醇诱导处理后显著增加。这些结果说明双环醇通过抑制细胞周期和诱导细胞自噬,来抑制HepG2的细胞活性。2.双环醇同时抑制PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路。通过western blotting方法,证明双环醇影响了G1期调控相关蛋白的活性。双环醇能够诱导p21CIP1和p27KIP1表达,抑制CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD复合体水平,将Rb蛋白去磷酸化导致细胞周期阻滞于G1期,同时本课题还发现双环醇通过抑制mTOR蛋白活性诱导了细胞自噬。通过进一步研究周期与自噬相关上游信号通路,发现双环醇显著抑制了AKT蛋白的磷酸化,下调了PI3K/AKT通路。转染AKTcDNA使双环醇对肿瘤细胞的周期抑制和自噬诱导效果降低,而转染AKT siRNA或加入化学抑制剂LY294002分别使双环醇的抑瘤作用加强。这些结果表明AKT在双环醇抑制肿瘤细胞活性过程中发挥重要的作用。另外,Ras/Raf/MEK/ERK通路也被双环醇所抑制。转染ERK siRNA或加入化学抑制剂PD98059也分别使双环醇周期抑制及自噬诱导效果增强。以上结果说明双环醇的细胞毒性效果与PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路有密切关系。3.通过裸鼠移植瘤模型研究双环醇在体内环境的作用。利用腋下移植方法将HepG2细胞移植于裸鼠,通过口服给药双环醇与索拉非尼。结果表明,双环醇减小了小鼠体内的肿瘤体积并且降低了肿瘤的重量,同时对小鼠不产生毒性。HE染色和TUNEL染色方法表明在肿瘤组织中双环醇引起了肿瘤细胞一定程度的死亡,而在肝组织中没有发现类似现象。对肿瘤组织进行western blotting和免疫组化实验,发现双环醇降低了肿瘤组织内的AKT和ERK磷酸化水平,抑制了蛋白活性。综上所述,双环醇对于肿瘤细胞的抑制增殖作用来源于细胞周期抑制与细胞自噬。在体外和体内环境中,双环醇的毒性与其对PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路的抑制作用有关。这些结果使人们对双环醇的药物效果有了更深的理解,为发展新的抗肿瘤药物奠定了一定的理论基础。