论文部分内容阅读
生物分子泛指生物体特有的各类有机分子,包括核酸、蛋白质、酶、细胞、组织和生物小分子等。生物分子的简单、快速及高效灵敏检测在疾病诊断、食品药品分析、环境监测和科学研究等方面具有十分重要的意义。众所周知,近年来出现过各种重大食品安全事件,使得食品污染在全国乃至全球日益受到重视;此外,疾病的早期诊断治疗对于人类的健康安全也是不容忽视的问题。通过对人体中葡萄糖、抗生素等多种生化指标的检测,可以为临床分析提供重要的依据,因此实现与食品监控、疾病诊断等方面有关的小分子物质的检测具有非常重要的意义。荧光生物传感器有着比传统方法更快捷、更灵敏、成本低的优点,现已被广泛应用到各个领域。基于以上原因,本文着重于通过构建不同信号放大方法来实现对不同目标物小分子的灵敏检测,具体研究内容如下:(1)高灵敏识别和检测非法添加到食品中的三聚氰胺。三聚氰胺的氮含量高,因此常被添加到牛奶中以提高其蛋白质含量,然而过量的三聚氰胺会导致人的身体组织,如肾脏等,受到伤害,而严重的肾功能衰竭有致人死亡的危险,因此对食品中三聚氰胺含量的监控非常重要。由于三聚氰胺可与两个胸腺嘧啶结合形成独特的稳定的T-三聚氰胺-T结构,以此为基础我们开发了一种基于T-三聚氰胺-T碱基错配介导的滚环扩增(RCA)信号放大方法,用于牛奶中三聚氰胺的高灵敏、无标记荧光检测。三聚氰胺的存在促进了两个含有T:T碱基错配的DNA链之间的杂交,这触发了RCA反应生成具有许多重复的长序列的G四链体片段。荧光染料硫黄素T能与所得到的长序列中的G四链体结合,显示出显著增强的荧光,可无标记地检测到低纳摩尔水平的三聚氰胺。此外,所开发的方法对于牛奶样品中三聚氰胺的鉴别和检测具有高度的选择性。通过合理的设计,可望将该方法应用于其他生物分子的检测。(2)高灵敏检测食品中的卡那霉素对于食品安全息息相关,在本研究中我们建立了一个基于引物交换反应及DNAzyme扩增放大技术相结合的荧光传感器,实现了牛奶中卡那霉素的高特异性检测。目标分子卡那霉素能够特异性地与适配体结合,暴露出发夹探针HP1上与辅助链结合的支点,然后在聚合酶的存在下引发辅助链的延伸,通过引物交换反应生成无数镁离子DNAzyme。接下来,DNAzyme特异性识别带有切割位点的发夹HP2并对发夹进行切割,释放出大量G四链体序列,G四链体序列中嵌入荧光染料ThT后,产生了显著增强的荧光信号。通过该传感器实现了低至nM检测限的卡那霉素的高灵敏检测,此外,通过合理的设计,可以将该方法用于其他生物分子的检测,为食品安全的监测提供了便利。(3)ATP是生物体的直接能量物质,在活细胞中扮演了能量货币这一重要角色,因此高灵敏和高选择检测浓度异常的ATP对于许多生物过程和疾病阶段的监测至关重要。通过由目标分子引发链置换,进而形成多个循环,我们建立了一种基于适配体的高灵敏、无标记的生物传感器用于人血清中ATP的荧光检测。目标物ATP分子与含有适体的双发夹探针结合,并引起双发夹结构探针构象发生变化,然后在聚合酶和核酸内切酶的存在下,以启动链延伸/剪切扩增与目标物循环过程,产生大量的G四链体序列。随后,有机染料硫黄素T结合这些G四链体序列,以产生显著增强的荧光发射信号,从而无需使用任何标记物即可实现对5至200 nM范围内的ATP的高度灵敏检测,其检测限低至2.2 nM。我们提出的适体传感方法还具有很高的选择性,并在稀释的人血清样品中检测到低浓度的ATP,这为建立有效的信号放大手段(用于检测痕量水平的各种生物分子)提供了广阔的机会。