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目的:随着全球人均寿命的延长,老年人群所占的比例越来越大,痴呆的发病率也在逐年攀升。目前,血管性痴呆(vascular dementia,VD)在西方国家已成为继阿尔茨海默病(Alzheimer’Disease,AD)后的第二大痴呆类型,在某些亚洲国家已成为老年人痴呆的首要原因。但是由于其发病机制的复杂,目前尚未出现一种能明确治疗VD的药物。施普善(cerebrolysin,CBL)是一种蛋白水解的肽类物质,它的作用类似于内源性神经营养因子,可以改善认知功能,但是在慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)所致的VD中,作用机制仍未阐明。本实验旨在观察VD大鼠学习记忆能力、海马CA1区形态学的变化,并且以CREB、p-CREB、Bcl-2、Bax作为实验研究指标,来观察CBL的干预作用。方法:以3月龄250-300g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象,采用双侧颈总动脉结扎(bilateral common carotid artery occlusion/two vessel occlusion,BCCAO/2VO)的手术方式来建立VD动物模型。随机分为4组:假手术组(Sham组),2VO模型组,CBL低剂量治疗组(2.5ml/kg)和CBL高剂量治疗组(5ml/kg)。术后24h经腹腔注射给予CBL低剂量组2.5ml/kg/d、CBL高剂量组5ml/kg/d、假手术对照组、2VO模型组等剂量生理盐水腹腔注射,连续给药28天。28天后通过Morris水迷宫测定行为学的变化,水迷宫实验完成后,在光镜下观察四组大鼠的海马组织形态学变化;使用Western blot法定量分析海马区p-CREB、CREB、Bcl-2、Bax的表达情况,免疫组织化学技术测定海马CA1区p-CREB表达变化。结果:1大鼠行为学测试结果1.1各组大鼠的学习情况:在定位航行阶段,2VO模型组大鼠与Sham组相比,逃避潜伏期明显延长(P<0.05);而给予CBL治疗后(高低剂量组),缩短了逃避潜伏期的时间,明显提高了学习能力。1.2记忆能力测试情况在空间探索试验中,2VO模型组大鼠在目标象限停留的时间比值较sham组明显缩短(P<0.01),而给予CBL治疗后的两组大鼠在目标象限停留的时间比值较2VO模型组明显延长(P<0.05)。2海马区形态学改变情况Sham组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、层次分明,结构清晰,细胞核形状规则,核仁清楚,细胞浆染色均匀。与Sham组相比,2VO模型组:海马CA1区神经元丢失明显,细胞排列松散不规则,大量胞体固缩,细胞核形状不规则,核仁消失,部分细胞坏死,胞质呈强嗜酸性。CBL治疗组(尤其是高剂量组)与2VO模型组相比,海马CA1区细胞密度增加,细胞层次较清晰,排列较整齐,细胞核规则,核仁清晰,偶见少量核固缩变性的神经元。3 Western blot结果3.1 VD大鼠海马CREB、p-CREB、Bcl-2、Bax蛋白的表达变化:3.1.1与sham组对比,CREB及p-CREB蛋白表达水平下降,后者具有统计学意义(P<0.01)。3.1.2与sham组对比,Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平升高,两者均具有统计学意义(P<0.01)。3.2 CBL对VD大鼠海马CREB、p-CREB、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响:3.2.1 CBL治疗组与2VO组相比,CREB及p-CREB蛋白表达水平增加,后者具有统计学意义(P<0.05)。3.2.2 CBL低剂量治疗组与2VO组相比,Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少,两者均具有统计学差异(P<0.05);CBL高剂量治疗组与2VO组相比,Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01),Bax蛋白表达下降(P<0.05)。3.2.3 CBL低剂量与CBL高剂量相比,CREB、p-CREB、Bcl-2、Bax蛋白表达有变化,但无统计学差异。4免疫组化方法检测大鼠海马p-CREB的表达变化光镜下可见p-CREB免疫阳性表达,免疫阳性反应物呈棕黄色,在神经元胞浆和胞核均有表达。Sham组海马CA1区p-CREB有明显表达,2VO组CAI区p-CREB表达低于Sham组和CBL治疗组,图像分析结果表明,2VO组p-CREB阳性反应产物平均光密度明显低于Sham组和CBL治疗组(前者P<0.01,后者P<0.05)。结论:1 采用BCCAO建立的VD模型是一种稳定、有效、理想的动物模型。2 海马CA1区神经元结构破坏和丢失可能是VD模型学习记忆下降的形态学基础。3 CBL可有效改善VD大鼠认知功能,提高其空间学习记忆能力,改善其海马区病理损伤。作用机制可能与调节CREB和抑制凋亡蛋白相关。