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绵羊瘤胃上皮作为与环境接触的免疫界面,能够分泌具有针对各种病原体的抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)。防御素作为机体内正常产生的AMPs,具有广谱的抗微生物活性,而绵羊β-防御素-1(Sheep β-defensin-1,SBD-1)作为防御素家族的一员,在整个胃肠道内广泛表达,因此SBD-1可能在绵羊胃肠道先天性免疫中发挥着重要作用。本课题组前期的研究表明酿酒酵母菌及其全细胞壁均能诱导绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)内SBD-1的表达,而甘露聚糖作为酿酒酵母细胞壁的主要成分,具有刺激先天性和适应性免疫反应功能。因此,本试验首先对ORECs的培养、冻存和复苏方法进行研究,然后研究了酿酒酵母甘露聚糖对ORECs SBD-1的表达影响,最后对甘露聚糖诱导SBD-1表达所激活的信号通路进行探索。具体研究内容及结果如下:(1)采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织分别进行7次不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和细胞进行观察,以确定消化程度。结果发现第4次消化后即可开始收集细胞,并进行原代培养。同时运用差时消化法和差速贴壁法对培养的细胞进行纯化,并利用免疫组化、免疫荧光、细胞生长曲线和RT-PCR方法证实所培养的细胞为ORECs。然后通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率发现冻存液的配制比例为VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1时,冷冻保护效果较好。最后对复苏后的ORECs生物学活性进行检测,结果表明复苏后的细胞同样具有原代ORECs的生物学特性,可用于后续试验研究。(2)用不同浓度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的甘露聚糖刺激ORECs 8 h后,筛选出甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳浓度;然后用最适浓度的甘露聚糖刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h)后,筛选出甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳时间。qPCR和ELISA结果均显示甘露聚糖能够诱导ORECs SBD-1的表达,且当浓度为50 μg/mL的甘露聚糖刺激ORECs4h时SBD-1的表达量达到最大。(3)采用Western blot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光、qPCR和ELISA方法对甘露聚糖诱导SBD-1表达所激活的信号通路进行研究。结果表明:膜受体树突状细胞相关 C 型凝集素 2(Dendritic-cell-associated C-type lectin 2,Dectin-2)和信号衔接蛋白脾脏酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在ORECs内均表达,并且用Dectin-2和TLR-2的siRNA或特异性封闭抗体处理ORECs后均可以减弱甘露聚糖诱导SBD-1的表达,且阻断Dectin-2对SBD-1表达的抑制作用更明显。然后用Syk siRNA或Syk特异性抑制剂R406处理细胞后同样发现阻断Syk能够降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达。最后分别用p38、JNK、ERK1/2和NF-κB信号通路的特异性抑制剂处理ORECs后均显著降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达,且p38通路抑制剂效果最明显。本研究通过消化时间的确定,成功培养出了 ORECs。冻存液的配制比例为VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1时,对ORECs的冷冻保护效果较好,且复苏后的细胞同样具有原代ORECs的生物学特性。此外,甘露聚糖能够诱导ORECs SBD-1的表达,且膜受体Dectin-2和TLR-2,信号衔接蛋白Syk以及下游的信号通路p38、JNK、ERK1/2和NF-κB均参与甘露聚糖诱导SBD-1的表达过程,但可能以Dectin-2-Syk-p38信号通路为主要的信号通路。