【摘 要】
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甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是植物体内合成甜菜碱过程中的关键酶。甜菜碱是一种小分子、非毒性的渗透调节物质,在植物耐盐中起着重要的作用。BADH基因受盐诱导表达,其表达与其启动
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甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是植物体内合成甜菜碱过程中的关键酶。甜菜碱是一种小分子、非毒性的渗透调节物质,在植物耐盐中起着重要的作用。BADH基因受盐诱导表达,其表达与其启动子(pB:-300～+62bp)有关。pB是盐诱导表达启动子,在400mmol/L NaCl胁迫诱导时,其驱动的GUS活性是未经NaCl诱导时的6.3倍。
本论文构建了辽宁碱蓬pB启动子驱动BADH基因的植物表达载体,转化到农杆菌中构建工程菌,利用农杆菌介导的叶盘转化法分别将pB-BADH和CaMV35S-BADH转入烟草中。对两种类型的转基因烟草中BADH基因表达和甜菜碱含量进行分析。主要结果如下:
1.通过PCR技术从克隆载体pMD18-T-BADH中扩增出约1.5kb的BADH基因编码区,通过酶切、连接,替代原表达载体pCAMBIA1301-pB-GUS中的GUS报告基因获得新的表达载体pCAMBIA1301-pB-BADH,并通过冻融法导入大肠杆菌DH5a,得到了E.coli.pCAMBIA1301-pB-BADH；
2.将构建好的表达载体通过冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中,获得工程菌LBA4404-pCAMBIA1301-pB-BADH；
3.采用农杆菌介导的叶盘转化法将pB-BADH和CaMV35S-BADH转入烟草。PCR检测获得了阳性植株。半定量RT-PCR检测表明,转CaMV35S-BADH烟草中BADH基因的表达量明显高于转pB-BADH烟草；甜菜碱含量测定表明,转pB-BADH烟草甜菜碱的含量与野生烟草的甜菜碱含量相当,转CaMV35S-BADH烟草的甜菜碱含量普遍高于转pB-BADH烟草。
4.0.1mol/L NaCl处理转基因及对照烟草24 h后,半定量RT-PCR检测表明,转pB-BADH烟草的BADH表达量明显高于转CaMV35S-BADH烟草；甜菜碱含量测定表明,转pB-BADH烟草甜菜碱的含量较无处理时明显增加,并且高于野生烟草和转CaMV35S-BADH烟草。
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