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基于荧光蛋白的生物传感器由于能够实现对生物化学反应多尺度(从单个分子到单细胞甚至整个生物体)检测,现在已经成为生物学研究的强有力工具。较传统的生物化学检测方法而言,基于荧光蛋白的生物传感器能够对细胞内的代谢分子实现时空特异性检测。在过去的几十年里许多的研究人员倾注了大量心血发展基于荧光蛋白的遗传编码荧光探针。但如何快速的获得对特定代谢分子响应识别生物传感器急待我们解决。诸如与肿瘤细胞增殖直接相关的代谢分子(如葡萄糖)急需新一代的生物传感器提高检测的准确性。另外现在的基于荧光蛋白的生物传感器都或多或少有一定的pH敏感性,我们期望能够通过pH耐受荧光蛋白开发出非pH敏感的生物传感器。 本文设计了一种将细菌周质结合蛋白(PBP)和环化重排荧光蛋白(cpFP)进行特异性融合用于快速获得对配体分子识别响应的单荧光蛋白生物传感器构建方法。通过将cpFP融合到PBP的特定位点,从而实现当PBP与配体相互作用时融合的cpFP发生相应的构象变化并且产生荧光强度的变化。我们选择了PBP家族中的I型葡萄糖结合蛋白GBP和Ⅱ型的组氨酸结合蛋白HBP作为研究对象,我们发现在以上两个PBP蛋白融合cpFP都能够快速的获得对配体分子识别的嵌合体荧光蛋白生物传感器。 通过融合HBP和cpYFP构建的嵌合体荧光探针FhisJ22μ,我们对哺乳动物细胞中的组氨酸亚细胞器分布进行原位定量检测分析。另外我们通过FhisJ22μ实现对哺乳动物细胞中的组氨酸的时空特异性动态分析,结果表明HeLa细胞胞浆和线粒体组氨酸摄取的表观K0.5值均约为55μM。而且组氨酸摄取过程不依赖于细胞的能量代谢状态。FhisJ22μ将帮助加深我们了解组氨酸在生命过程中的生物学功能。 通过融合GBP蛋白和cpFP,得到了一系列不同颜色的葡萄糖探针,进一步截短优化和配体结合口袋的定点突变优化获得对葡萄糖最大响应高达近7倍FGBP1mM嵌合体荧光蛋白突变体。通过FGBP1mM和FGBP3.1μM我们对大肠杆菌和HeLa细胞中的葡萄糖进行了原位动态检测。FGBP1mM检测发现Mlc敲除大肠杆菌和野生型大肠杆菌之间的葡萄糖摄取差异。FGBP31μM检测发现HeLa细胞的葡萄糖代谢水平受到谷氨酰胺的影响。FGBP系列探针将会帮助我们更好的理解葡萄糖在生理过程中作用和功能。 细胞微环境中存在一定的pH波动,但是氧气依赖的类GFP荧光蛋白都不同程度上对pH表现出一定的敏感性。这里我们选择一种胆红素激活的非氧气依赖的对pH不敏感的荧光蛋白UnaG进行探针构建。我们通过在UnaG的表面引入能够可逆形成二硫键的半胱氨酸对和定点突变优化可逆二硫键形成速度的方法发展了一种对氧化还原敏感的UnaG荧光蛋白突变体。roUnaG从氧化状态到还原状态会产生8倍的荧光强度升高。roUnaG可以实现在不同的生物细胞中表达并且对活细胞内的氧化还原变化进行检测。由于roUnaG继承了母系荧光蛋白UnaG的特性:对pH的不敏感性和对氧气不依赖性,这使得其在pH波动环境和某些极端环境下可以作为氧化还原生物学研究重要工具。 基于cpFP的单荧光蛋白探针较FRET荧光蛋白对探针有着较小的分子量和对检测分子较大的响应识别。这使得这类探针能够较好的在宿主细胞内表达,同时能够在复杂生物环境中准确的获得检测分子的生理波动变化。本文构建的组氨酸、葡萄糖cpFP荧光蛋白探针较第一代FRET探针来说都有着更高的响应识别。这将为相关代谢物的代谢研究提供有力的原位在线代谢分析工具。另外通过pH不敏感荧光蛋白UnaG的改造获得了对pH不敏感的氧化还原敏感荧光蛋白,这项尝试性研究不仅为氧化还原代谢研究提供有力工具,并且拓宽了荧光蛋白生物传感器构建元件的范畴,尤其是pH不敏感荧光探针构建元件。