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灯盏细辛[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]为菊科(Asteraceac)飞蓬属(Erigeron)多年生草本植物,主要分布于中国西南地区。灯盏细辛是重要的中药材,所含灯盏乙素和黄酮类化合物对治疗闭塞性脑血管疾病所致瘫痪疗效显著。随着医药市场对灯盏细辛药品需求量的增加,其野生资源不断减少,目前已很少有成片分布的灯盏细辛。灯盏细辛的已有研究多集中于化学成分的分离与鉴定、药理功能及临床应用等方面,但对物种的准确鉴定、居群遗传多样性研究较少。本研究采用常规压片法,对灯盏细辛及其4个近缘种进行染色体核型分析,并结合前人工作,探讨其染色体多样性。利用微卫星引物开发技术,筛选了多态性高、易于扩增的灯盏细辛特异性微卫星引物,并从中挑选效果较好的合成荧光标记引物对灯盏细辛进行了居群遗传结构分析。主要研究结果如下:
1、灯盏细辛及其近缘种的细胞学研究
对灯盏细辛37个居群及4个近缘种进行了染色体数报道与核型分析。结果表明:灯盏细辛所研究居群均为二倍体,共有12种不同的核型。其中2n=2x=8m+10sm和2n=2x=10m+8sm是最主要的两种核型。臂比范围1.39-2.29,核型不对称型共有2A、2B、3A、3B四种类型,其中2A为主要类型。除云南马龙居群(090393)外,其他所有灯盏细辛居群的T.C.值均超过60%。随体仅在会理、会东两个居群中有发现。
多舌飞蓬(E.multiradiatus)为二倍体居群,核型公式为2n=2x=18=2m+14sm+2st,臂比2.23,核型不对称型为3A型,T.C.值为69.08%。密叶飞蓬(E.multifolius)亦为二倍体居群,核型公式为2n=2X=18=4m+14sm,臂比1.96,核型不对称型为2B型,T.C.值为66.23%。石生紫菀(Asteroreophilus),二倍体,核型公式2n=2x=18=8m+10sm,臂比1.72,核型不对称型为2B型,T.C.值为63.22%。这三种植物的染色体数目属首次报道。小飞蓬(E.canadensis)为六倍体居群,核型公式2n=6X=54=36m+18sm,臂比1.34,核型不对称型为2B型,T.C.值为53.39%。
2、灯盏细辛微卫星引物开发
选取灯盏细辛5个居群中的32个个体,对所合成的59对微卫星引物进行筛选和鉴定。共有ll对引物具有多态性,对24个DNA样品进行扩增、记带和数据分析。每个位点的等位基因数为2-7,平均值4.273;观察杂合度0.250-0.958,平均值0.625;期望杂合度0.337-0.786,平均值0.574。引物EB-8,EB-10,EB-11,EB-28和EB-30(共五对)显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.01)。除EB-11和EB-17两引物外,其他引物之间没有显著的连锁不平衡。多态性引物的通用性检测表明,50%以上的多态引物能在小飞蓬和阿尔泰飞蓬中得到良好的扩增。这些多态引物可用于灯盏细辛居群遗传学与保护生物学研究,也可作为该物种的药材鉴定的分子标记。
3、灯盏细辛的居群遗传学研究
利用5对特异性的微卫星引物对23个灯盏细辛居群进行了居群遗传学研究。POPGENE分析表明:灯盏细辛具有较高的遗传多样性,平均有效等位基因为3.679,Shannon多样性指数为1.556,观测杂合度0.507,期望杂合度0.689,居群间分化值为0.166,居群间基因流1.257。AMOVA分析表明,15.23%的遗传变异存在于居群间,84.77%的遗传变异存在于居群内。遗传一致度范围为0.495-0.960,遗传距离范围为0.041-0.704。UPGMA聚类树没有显示灯盏细辛具有显著的地理结构,表明地理距离可能不是阻碍灯盏细辛基因流的有效障碍。灯盏细辛的这种居群遗传结构可能与其繁育系统和种子散布机制等生物学性状有关。