论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,其主要感染6~18周龄的仔猪,临床表现为进行性消瘦、发热、淋巴结肿大、黄疸和呼吸困难等症状。PCV2引起的相关疾病表现为世界流行,已经给世界各国的养猪产业造成了巨额经济损失,疫苗接种是控制该病毒在猪群中的爆发最有效的方法。目前市场上的PCV2商品化疫苗主要包括全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种,全病毒灭活苗方面,由于病毒自身的特点和生产工艺的问题,经常出现病毒滴度难以提高等技术问题,有时需要浓缩才能达到要求。亚单位疫苗主要是使用杆状病毒表达目的蛋白,免疫原性良好,但因其生产成本很高,难以在养殖生产中大规模使用。因此有必要研制高效实用、成本低廉的猪圆环疫苗,用以减少该病毒对养猪产业造成的损失。本研究主要探索了可以形成病毒样颗粒的PCV2全长Cap蛋白在原核表达系统中的表达,并将表达的目的蛋白制成病毒样颗粒疫苗,以小鼠为模型评价该颗粒疫苗的免疫原性,主要研究内容如下:1.重组表达质粒的构建与表达以流行毒株PCV2b 119-GD01株编码Cap的氨基酸序列作为基础序列,进行密码子优化和基因合成,得到目的基因r ORF2,并将r ORF2克隆到原核表达载体p ET-43.1a中进行诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE和Western-blot分析显示,诱导的融合蛋白约为100 KDa左右,并且主要以可溶形式存在,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上;通过镍柱亲和层析和凝血酶的进一步纯化,得到了高纯度的不含标签的Cap蛋白,并且重组蛋白和纯化后的无标签目的蛋白均与PCV2 Cap蛋白单抗具有良好的反应性。在电镜下观察纯化后的Cap蛋白,可以看到大量直径约为17 nm的病毒样颗粒,该病毒样颗粒与猪圆环病毒粒子的大小和结构相似。2.病毒样颗粒疫苗佐剂的筛选将表达的Cap蛋白分别与ISA201VG、ISA15VG、GEL01、铝胶佐剂乳化或混合制成疫苗,免疫小鼠,每周检测小鼠血清中针对Cap蛋白的特异性抗体水平。结果显示,铝胶佐剂组小鼠血清的特异性抗体在第二周即转阳,并且该组的抗体水平在首免后4~7周均高于商品化亚单位疫苗组,即阳性对照组,但略低于ISA201VG佐剂组,综合各佐剂的成本以及诱导机体产生特异性抗体的时间、水平等因素,筛选铝胶佐剂做为PCV2病毒样颗粒疫苗的候选佐剂。3.病毒样颗粒疫苗免疫次数的筛选以铝胶作为佐剂制备病毒样颗粒疫苗,分别采用免疫1次和免疫2次的免疫方式。免疫后血清中特异性抗体水平检测结果显示,免疫1次组和免疫2次组血清转阳均发生在第二周,且早于阳性对照组;整体抗体水平免疫1次组稍低于免疫2次组,但差异不明显,但二者均显著高于商品化亚单位疫苗组。综合血清转阳时间以及抗体水平等因素,初步选择该病毒样颗粒疫苗的免疫次数为1次。4.病毒样颗粒疫苗抗原免疫剂量的筛选试验组中每只小鼠按照20μg、40μg、60μg和80μg Cap蛋白的量进行免疫,检测免疫后各组特异性抗体产生情况。结果表明,血清中特异性抗体水平与免疫的抗原含量呈正相关;当免疫的抗原含量达到40μg每只小鼠时,即可在免疫后第三周甚至是第二周在小鼠体内检测到较高的抗体水平。初步确定小鼠的免疫剂量为每只每次40μg Cap蛋白。本文将通过原核系统表达的PCV2 Cap蛋白与铝胶佐剂混合,制成了PCV2病毒样颗粒疫苗。使用含有40μg Cap蛋白的该病毒样颗粒疫苗免疫小鼠,免疫后两周可在血清中检测到高水平的特异性抗体,证明该病毒样颗粒疫苗具有很好的应用前景。