mir-425对3T3-L1细胞分化的作用研究

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近年来,大量的研究表明,miRNA在脂肪细胞分化过程中发挥着重要的作用,miRNA通过靶定与脂肪细胞分化相关的基因来调控脂肪细胞分化。对miRNA进行序列保守性分析、靶基因预测和功能分析,从而选择miR-425-5p为研究对象。本试验采用双荧光素酶报告基因检测、实时定量PCR(Q-PCR)、免疫印迹(Western blot)等方法对miR-425-5p的作用和功能进行研究。主要的研究结果如下:  (1)经miRBase网站对多种物种的miR-425序列对比发现,包括猪在内的多种哺乳动物的miR-425-5p的成熟序列保守性很高,只有少许碱基不同,种子序列是完全相同的,保守性也很高。  (2)通过实时定量PCR技术检测miR-425-5p在5月龄大白猪心、肝、脾等多个组织中的表达量,结果显示:miR-425-5p在大白猪中的脂肪组织中的表达量最高,并且在所有脂肪组织中在腹脂中的表达量最高。  (3)在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中,miR-425-5p的表达量先下降后上升。转染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1细胞,诱导细胞分化8天,PPARγ、aP2和C/EBPα表达量明显下调,油红O染色也表明miR-425-5p减少脂滴的积累。另外,3T3-L1细胞试验组中,miR-425-5p明显降低细胞中甘油三酯的含量。  (4)根据miR-425-5p与靶基因的3UTR相对应的结合序列,构建了野生型和突变型双荧光素酶报告载体pmirGLO载体,并将这俩种质粒分别于miR-425-5pmimics以及NC共转染到BHK-21细胞中,检测荧光活性。结果显示,miR-425-5p能识别并结合Zfp423的3UTR对应序列。  (5)在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中,Zfp423的表达量先上升后下降的。转染miR-425-5p mimics和NC,miR-425-5p inhibitor和inhibitor NC到3T3-L1细胞并诱导分化6天。实时定量结果显示miR-425-5p在转染mimics后表达量明显比NC组高,在转染Inhibitor后表达量明显比Inhibitor NC组低,但是在Zfp423的mRNA水平上实验组和对照组没有明显差异。Westem blot结果显示miR-425-5p调控Zfp423转录后水平。  以上结果表明,miR-425-5p抑制Zfp423的翻译水平,从而抑制脂肪细胞分化过程。
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