【摘 要】
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p-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纤维二糖中的p-1,4-糖苷键,其作用直接影响纤维素的降解效率。p-葡萄糖苷酶被应用于酒类、茶类、饮料等工业上,取得了巨大的
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p-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纤维二糖中的p-1,4-糖苷键,其作用直接影响纤维素的降解效率。p-葡萄糖苷酶被应用于酒类、茶类、饮料等工业上,取得了巨大的经济效益。近年来p-葡萄糖苷酶逐步的应用于生产白藜芦醇和大豆异黄酮方面。本研究构建了本实验室自行筛选到的P.cookii GX-4的fosmid基因组文库,文库约有6000个克隆子。利用筛选平板从文库中成功的筛选获得4个具有p-葡萄糖苷酶活性的克隆,对其中2个克隆子进行亚克隆,发现都含有一个相同的2.3kb的ORF,对该ORF进行蛋白质结构组件分析,表明该ORF编码的蛋白质为GH3的p-葡萄糖苷酶,将这个基因命名为pbgl。利用PCR方法扩增Pbgl克隆到表达载体pSE380上,实现了pbgl基因在大肠杆菌中表达,通过镍亲和层析对Pbgl进行蛋白纯化,并进行了深入的酶学性质研究。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明Pbgl是以单体形式存在,目的蛋白质大小约为84kDa。以对硝基苯基-p-D-葡萄糖苷(pnpG)作为底物,Pbgl的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0,Km与Vmax值分别为0.1754±0.0194mM和149±3.4U/mg,葡萄糖抑制常数IC50值和Ki值分别为177.1mM和34.65mM。Pbgl能够水解纤维二糖、乳糖、苦杏仁苷、染料木苷和黄豆苷。本实验还对Pbgl中与葡萄糖耐受性相关的氨基酸进行了易错PCR和定点突变研究,共获得六个正向突变体,分别为Rpbgl、W60L、W386A、W386C、 W386F、W386L。对这六个突变体进行了酶学性质研究,发现与野生重组酶Pbgl相比,除Rpbgl之外其余五个突变体的酶活都存在不同程度的降低。并且W386A、W386C、W386F、W386L这四个突变体的最适温度由50℃降至40℃。在对突变酶的葡萄糖耐受性研究时,发现这六个突变体与野生酶相比均有一定程度的提高,其中W386C的葡萄糖耐受性最高,比野生酶提高了11.88倍。
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