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多发性硬化(MS)是一种免疫介导的中枢神经系统慢性脱髓鞘性疾病,其病理特点包括炎性细胞浸润、髓鞘脱失和轴索损伤等。本病好发于中青年,其主要临床特点为病灶的空间多发性以及时间多发性。MS呈慢性病程,复发率高,治疗费用高,致残率高,但预后差,并且缺乏有效的治疗措施,给家庭和社会带来巨大损失和负担。MS的病因复杂,涉及环境因素、氧化应激、病毒感染、遗传因素等诸多原因。尽管其发病机制尚未完全阐明,但越来越多的证据表明,炎症反应程度与疾病严重程度密切相关,促进炎症反应加重MS的发病,抑制炎症反应减轻MS的发病,Th1/Th17细胞平衡与Th2/Treg细胞平衡的紊乱对MS的发生起到了重要作用。具体到免疫炎性反应来说,Th1/Th17细胞平衡与Th2/Treg细胞平衡的紊乱对MS和EAE的发生起到了重要作用。原始的CD4+T细胞受激活后可以分化为Th1、Th17、Th2和Treg细胞。这些细胞以分泌炎症细胞因子的方式来参与炎症反应。其中Th1和Th17细胞为致炎细胞,其产生IFN-γ和IL-17等细胞因子具有促炎作用。IL-12对于Th1细胞的产生起重要作用,IL-6对于Th17细胞的产生有重要影响。Th2和Treg细胞均属于抑炎细胞,并且Th2和Treg细胞可分泌IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子,这些细胞因子对于自身免疫性疾病的发生发展也起到了抑制作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是MS经典的动物模型。最近一些实验研究证实,生成炎症介质的过程是高耗能的,炎症反应程度与细胞的能量代谢状态紧切相关,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为一种调控细胞能量代谢的关键激酶,它可通过沉默信息调节因子1(SIRT1)依赖的途径发挥抗炎效应。AMPK/SIRT1能量敏感通路的激活对炎症反应有着重要而显著的调控效应,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD~+的参与对此通路起着重要作用。AMPK通过增加NAD~+水平来激活SIRT1,活化的SIRT1则通过催化NF-κB、AP-1和组蛋白的去乙酰化反应来降低相关炎症因子的转录活性,使炎症相关因子含量减少,进而调控免疫炎症反应。大量研究表明,NAD~+在线粒体功能、能量代谢、基因表达、老化和钙通道稳态中均发挥重要作用。也有研究提出NAD~+治疗可降低由氧化应激导致的神经元和星形胶质细胞的死亡,并且能够调节CD4+细胞分化。这为我们探索NAD~+对EAE的治疗作用提供了初步的理论基础。在我们的研究中,我们利用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制备EAE模型,观察给予NAD~+干预是否对于EAE具有保护作用,以及它对EAE模型中各辅助型T细胞比例和免疫炎症反应程度的影响,并对NAD~+是否通过调节AMPK/SIRT1通路来进一步保护进行研究第一部分烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎保护作用的效果分析及病理学研究目的:建立经典的小鼠多发性硬化动物模型之后,使用NAD~+进行药物干预,评估不同组别小鼠的发病情况,通过HE染色、WEIL染色等病理学的实验方法,从病理学层面观察NAD~+对多发性硬化小鼠发生的相关病理改变的作用效果,研究NAD~+能否改善多发性硬化形成的炎症反应、轴索损伤和髓鞘缺失。方法:1选取实验动物。采用清洁级雌性C57BL/6小鼠,周龄大约为8-10周,体重大约为18-20g,小鼠购于北京维通利华实验动物公司。将小鼠饲养在恒温恒湿的环境中,保持明、暗12小时交替循环,并保证小鼠拥有充足的饮水和食物。2建立EAE动物模型。将MOG35-55多肽用生理盐水稀释成10mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)和一定量的结核菌素相互混合形成油包水乳剂,最终使结核杆菌H37Ra浓度为4mg/ml,并于小鼠脊柱两旁分4点皮下注射0.1ml的乳剂,之后分别在免疫第0天(0h)及第2天(48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX)。3建立EAE动物模型后,将EAE小鼠随机分为EAE模型组和NAD~+治疗组,并同时取未免疫正常小鼠作为正常对照组。NAD~+溶于磷酸盐缓冲液中,每日现配现用。自免疫后第1天(免疫当日记作第0天)开始,NAD~+组小鼠给予每日腹腔注射NAD~+250mg/kg,正常对照组和EAE模型组小鼠则每日腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液。自免疫后的第1天,分别由两名观察者分两次采用双盲法于每天早晚(8:00和16:00)两次对小鼠神经功能进行评分并同时测量体重,直至观察结束对小鼠进行处死。神经功能评分使用的是更为详尽的Weaver(15分)法。4组织病理学观察。小鼠使用水合氯醛进行麻醉,并使用4%多聚甲醛进行灌注,取小鼠的脊髓腰膨大处行石蜡包埋处理,5μm厚度切片。在光镜下,通过HE染色和WEIL两种染色方法观察小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况,每只小鼠选取3张脊髓组织进行切片,并且每张切片分别选取5个高倍(400×)视野对炎性细胞浸润的严重程度进行评分定量处理,计算每只小鼠平均炎性评分。5免疫组化病理学观察。小鼠使用水合氯醛麻醉,并用4%多聚甲醛灌注小鼠后,取小鼠脊髓腰膨大处制成石蜡切片,5μm厚度切片。通过MBP和NF200染色,光镜下观察小鼠髓鞘脱失和轴索损伤情况。6采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以―均数±标准差((?)±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。发病率以百分数表示,并用卡方检验进行统计学分析。临床神经功能评分用Mann–Whitney U检验。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA检验,两两比较用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1应用NAD~+进行药物干预,可以降低EAE小鼠的神经功能评分并改善临床症状,还可以减少EAE小鼠的发病率,推迟起病时间;2应用NAD~+进行药物干预,可以抑制EAE小鼠的炎细胞向中枢神经系统的浸润,并且能够起到保护髓鞘和降低轴索损伤的作用。第二部分烟酰胺腺嘌呤二核苷酸能够通过影响T细胞分化和调节免疫炎症反应对实验性自身免疫性脑脊髓炎起保护作用目的:使用MOG35-55诱导C57BL/6小鼠建立EAE的动物模型,并用NAD~+进行干预,观察NAD~+治疗组和EAE模型组各辅助性T细胞数量以及功能的变化,为NAD~+对于EAE的保护作用是否通过调节T细胞分化及功能提供实验依据。方法:1选取实验动物。采用清洁级雌性C57BL/6小鼠,周龄大约为8-10周,体重大约为18-20g,小鼠购于北京维通利华实验动物公司。将小鼠饲养在恒温恒湿的环境中,保持明、暗12小时交替循环,并保证小鼠拥有充足的饮水和食物。2建立EAE动物模型。将MOG35-55多肽用生理盐水稀释成10mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)和一定量的结核菌素相互混合形成油包水乳剂,最终使结核杆菌H37Ra浓度为4mg/ml,并于小鼠脊柱两旁分4点皮下注射0.1ml的乳剂,之后分别在免疫第0天(0h)及第2天(48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX)。3应用流式细胞仪检测Th1、Th2、Th17细胞及Treg细胞的比例。在每个流式上样管中加入细胞数大概为1×106个,体积为100μl的细胞悬液,用于检测Th1、Th2、Th17细胞。用荧光单克隆抗体FITC-CD4 0.25μl标记细胞表面抗体。而Treg细胞用荧光单克隆抗体FITC-CD4 0.25μl和APC-CD25 0.3μl标记细胞表面抗体,室温避光孵育30 min;破膜固定后加入PE-IFN-γ抗体1.25u1标记胞内IFN-γ,APC-IL-4抗体1.25u1标记胞内IL-4,APC-IL-17A抗体0.625u1标记胞内IL-17,2.5μl PE-Foxp3标记胞内Foxp3,室温避光孵育60min,Flow Cytometry Staining Buffer洗涤并重悬细胞后上流式细胞仪检测。4采用ELISA的实验方法检测脾细胞上清培养液中细胞因子的含量。我们收集脾胞上清液用于定量分析检测IFN-γ,IL-17,TGF-β,IL-10,IL-6,IL-1β炎症因子的含量。实验操作严格依据各试剂盒的相关操作说明书。5采用q PCR的实验方法检测T-bet,STAT3,RORγt,Foxp3,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β,IFN-γ,IL-2,IL-12和IL-17A表达情况。6采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以―均数±标准差((?)±s)表示。对实验数据行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA检验,两两比较用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1应用NAD~+干预,可以降低EAE小鼠Th1和Th17细胞比例。同正常对照组相比,EAE组小鼠的Th1细胞和Th17细胞的比例显著升高,而Th2和Treg细胞比例显著下降,而NAD~+治疗组小鼠Th1和Th17细胞比例较EAE小鼠相比明显下降,用RT-PCR方法检测STAT3、RORγ和T-bet m RNA的转录水平。在EAE组小鼠脾细胞中,STAT3、RORγ和T-bet m RNA转录水平比空白对照组显著增高,而NAD~+组STAT3、RORγT和T-bet m RNA转录水平较EAE组降低;2应用NAD~+干预,可以降低Th1细胞和Th17细胞的特征性炎症细胞因子的含量。采用ELISA的方法并在发病高峰期取材,我们发现在EAE组小鼠中,IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ含量与正常对照组相比显著增高,而NAD~+治疗组的IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ的含量与EAE组小鼠相比显著减低,在EAE组小鼠中,IL-10和TGF-β含量与正常对照组相比显著降低,NAD~+治疗组IL-10和TGF-β含量与EAE小鼠组相比显著增高;3应用NAD~+干预,可以降低Th1细胞和Th17细胞的特征性炎症因子m RNA的转录水平。采用RT-PCR的方法并在小鼠发病高峰期取材,我们发现在EAE组小鼠中,IL-1β、IL-6、IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-17A m RNA转录水平与正常对照组相比显著增高,而NAD~+治疗组中IL-1β、IL-6、IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-17A m RNA转录水平较EAE组小鼠显著减低,而在EAE组小鼠中,IL-10和TGF-β的m RNA转录水平与正常对照组相比显著降低,NAD~+治疗组中IL-10 m RNA转录水平较EAE组显著增高。第三部分烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过激活AMPK/SIRT1通路发挥对实验自身免疫性脑脊髓炎的保护作用目的:使用MOG35-55建立C57BL/6小鼠的EAE动物模型,并用NAD~+进行干预,采用Western blot方法测定小鼠AMPK磷酸化程度、P65磷酸化程度和SIRT1蛋白的表达情况,进一步阐述NAD~+治疗EAE的作用机制。方法:1选取实验动物。采用清洁级雌性C57BL/6小鼠,周龄大约为8-10周,体重大约为18-20g,小鼠购于北京维通利华实验动物公司。将小鼠饲养在恒温恒湿的环境中,保持明、暗12小时交替循环,并保证小鼠拥有充足的饮水和食物。2建立EAE动物模型。将MOG35-55多肽用生理盐水稀释成10mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)和一定量的结核菌素相互混合形成油包水乳剂,最终使结核杆菌H37Ra浓度为4mg/ml,并于小鼠脊柱两旁分4点皮下注射0.1ml的乳剂,之后分别在免疫第0天(0h)及第2天(48h)分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX)。3用Western blot方法法检测AMPKα、phospho-AMPKα、SIRT1、P65、phospho-P65的蛋白表达情况。4采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以―均数±标准差((?)±s)表示。对数据行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA检验,两两比较用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1应用NAD~+干预,能够激活AMPK/SIRT1通路从而对EAE小鼠起保护作用。在疾病高峰期,EAE组小鼠p-AMPK和SIRT1蛋白的表达含量同正常对照小鼠相比显著降低,而NAD~+治疗组小鼠p-AMPK和SIRT1蛋白的表达含量同EAE组小鼠相比明显增高;2应用NAD~+干预,可以降低p-p65蛋白的表达含量。在疾病高峰期,EAE组小鼠p-p65蛋白的表达含量同正常对照小鼠相比显著增高,而NAD~+治疗组小鼠p-p65蛋白的表达含量同EAE组小鼠相比明显降低。结论:1 NAD~+干预能够抑制EAE病情的进展,并且能够改善EAE的病理变化,减轻炎症反应,改善脱髓鞘和轴突损失的情况。2 NAD~+干预可以调节Th1/Th17细胞比例并且可以降低Th1细胞和Th17细胞的特征性炎症因子和转录的表达从而保护EAE。3 NAD~+干预能够抑制炎症反应可以通过激活AMPK和SIRT1通路和抑制NF-κB从而保护EAE。