论文部分内容阅读
肺癌是世界上最常见的癌症,为一种异质性、复杂性和挑战性的疾病,而且它的新发病例逐年上升。天然产物作为新药研发的重要来源之一,这就促使我们在天然产物中寻找效果更好或有新靶点的抗肿瘤化合物。薯蓣皂苷元是从薯蓣属植物的根茎中提取出来的一种植物甾体皂苷,是合成甾体类激素的重要原料。现代药理学研究证明,薯蓣皂苷元具有抗肿瘤、抗炎、降血脂和免疫调节等功能,并且毒副作用较低,应用广泛。本课题组致力于薯蓣皂苷元的结构修饰和活性筛选,发现经过结构修饰的薯蓣皂苷元衍生物具有很强的抗肿瘤活性。在本论文中,我们研究了化合物7在人非小细胞肺癌A549细胞中诱导细胞死亡的方式和机制。MTT法对一系列薯蓣皂苷元衍生物进行抗肿瘤活性筛选,筛选出最有潜力的化合物7进行后续机制研究。观察药物对细胞形态影响时,发现化合物可以诱导肿瘤细胞产生明显的空泡,空泡不断增多,相互融合,最终细胞膜破裂,细胞死亡。用PI染色流式细胞仪检测发现,化合物7导致A549细胞阻滞在G0/G1期。Annexin V/PI双染并用流式细胞仪测定细胞的凋亡率,Western blot测定PARP蛋白,广谱的凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)测定细胞死亡率,均显示化合物7不会引发caspase依赖的凋亡。进一步通过线粒体和内质网荧光探针,透射电镜,mRFP-GFP-LC3腺病毒转染,表明化合物7不能诱导旁凋亡或者自噬性细胞死亡。化合物7可以增加细胞内Lucifer yellow的摄取,空泡呈现出晚期内体Rab 7的特征,而没有早期内体Rab 5的特征,并且不能与溶酶体融合,部分与AO融合。预先加入巨泡性死亡抑制剂Baf-Al发现可以完全抑制细胞出泡和逆转细胞死亡,EIPA可以逆转细胞出泡,表明化合物7是通过巨泡性死亡诱导肿瘤细胞死亡。通过建立来源于A549细胞的裸鼠荷瘤模型来评价化合物7在体内的抗肿瘤作用。给药16天后,取出肿瘤组织称重并经过HE染色分析,结果表明化合物7在体内能够诱导肿瘤细胞发生巨泡性死亡。苔藓植物含有丰富的次级代谢产物,具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌和昆虫拒食等多方面的生物活性。本课题组致力于苔藓及其次级代谢产物的提取分离,结构修饰和活性发现。溶酶体在肿瘤细胞中具有数量多,囊泡大,溶酶体膜更为脆弱以及高的组织蛋白酶活性等特点,因此溶酶体是一个较好的抗肿瘤靶点。我们先前的研究表明,天然的大环双联苄Riccardin D的衍生物Riccardin D-N(RD-N)能够在体外富集于溶酶体并导致细胞死亡。为了进一步增强其抗肿瘤活性,我们尝试在Riccardin D中引入含氮基团来增强化合物的碱性,从而更好的发挥靶向溶酶体抗肿瘤的作用。通过MTT法检测细胞毒力,流式细胞仪检测凋亡和共聚焦显微镜观察AO和Lyso-Tracker Red的染色。结果表明,化合物11b和18a能够在体外显著抑制A549细胞增殖,细胞不能顺利加载线粒体荧光探针和吖啶橙,破坏了溶酶体的酸性结构,导致溶酶体膜透化,最终引起细胞凋亡和坏死。这些结果揭示了化合物11b和18a诱导细胞死亡的潜在机制,为发展更有效的抗肿瘤化合物提供了一定的理论依据。本论文的创新性及意义:1.本论文首次证明薯蓣皂苷元衍生物化合物7在体内和体外通过巨泡性死亡诱导肿瘤细胞死亡。2.本论文阐明了片叶苔素D衍生物11b和18a靶向溶酶体,诱导LMP,启动细胞凋亡和坏死来杀死肿瘤细胞。