论文部分内容阅读
背景及目的: Crispr/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统最早发现于被称为“细菌的免疫作用”的链球菌对外来核酸如噬菌体的剪切，于2013年发展成为一种新的基因编辑技术。Crispr/Cas9系统载体设计较为简单，不仅可以应用在微生物和植物细胞中，而且可以在更为高等的哺乳动物细胞中进行基因编辑。Cas9核酸内切酶剪切基因组DNA后，细胞利用同源重组方式（HDR）或者非同源重组的末端连接方式（NHEJ）进行DNA修复。其中NHEJ为非保真性的修复方式，可能导致基因组DNA产生错误修复甚至导致移码突变，从而达到基因敲除的目的。与传统的同源重组技术相比，Crispr/Cas9技术敲除效率较高，不需要药物筛选，且可以实现多种基因的同时敲除。与近几年发展的ZFNs技术和TALENs技术相比，Crispr/Cas9技术靶向序列设计和敲除载体的构建更为简单，可以大大缩减基因敲除的周期和费用，被《Science》和《Nature》杂志同时评为2013年度十大科学进展之一，已逐渐成为基因敲除新的替代方法。目前相比起传统的基因敲除技术，Crispr/Cas9技术正处于初步研究的阶段，然而已于近两年取得了很大的进展，除了在细胞中进行基因敲除的应用，还可以用于定点敲入，RNA干扰，合成生物学等等。 中华仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）是药用重组蛋白表达最常用的宿主细胞，CHO细胞中的?-1,6岩藻糖转移酶基因（FUT8基因）负责将岩藻糖加入到表达抗体的N-糖链上，而岩藻糖的存在会极大地降低抗体的ADCC作用。GS-CHO系统是最常用的两种CHO表达系统之一，相对于另一种常用的CHO-DHFR系统产量更高，筛选时间更短。CHO细胞中内源性谷氨酰胺合成酶基因（GS基因）的存在能够部分抵消GS特异性抑制剂氨基亚砜甲硫氨酸（MSX）的作用，阻碍了该系统的进一步运用。本研究利用Crispr/Cas9技术对CHO细胞进行细胞工程改造，同时敲除FUT8基因和GS基因，探索Crsipr/Cas9技术在CHO细胞工业生产中的应用。 方法: 对于FUT8基因的敲除，选择FUT8基因的酶催化关键部位外显子6（exon6）设计向导RNA（SgRNA）。敲除载体转染CHO-K1细胞后，T7限制性内切核酸酶切（T7E1酶切）检测基因敲除效率，并通过兵豆凝集素（LCA）富集FUT8-/-克隆，有限稀释挑选单克隆。通过 DNA测序鉴定，FITC-LCA膜结合表型鉴定等实验确定 FUT8在CHO-K1细胞中的成功敲除。在敲除得到的CHO FUT8-/-克隆中，转染抗CD20单克隆抗体表达载体，无血清驯化后表达纯化抗体，采用凝集素亲和Lectin Blot对表达抗体是否含有岩藻糖进行鉴定。我们在CHO FUT8-/-克隆中进一步敲除GS基因，选择GS基因的酶催化关键部位exon10设计两条SgRNA，共转染两条SgRNA。有限稀释后挑取单克隆，并通过DNA测序，Western Blot鉴定，和生存率与谷氨酰胺的依赖性实验确定 GS基因的成功敲除。选择 CTLA4Ig作为模式蛋白，转染CHO FUT8-/- GS-/-细胞，探索GS基因敲除后CHO细胞表达系统的优越性。 结果和结论： 通过T7E1酶切、DNA测序、FITC-LCA膜结合等实验，成功获得3株基因敲除的CHO FUT8-/-克隆。与野生型CHO-K1细胞相比具有相似的生长速率，同时在CHO FUT8-/-细胞中表达抗CD20单克隆抗体，经lectin blot鉴定表达抗体无岩藻糖存在。同时在CHO FUT8-/-克隆中成功敲除 GS基因，得到两株 CHO FUT8-/-GS-/-克隆。DNA测序结果表明GS两条等位基因具有大片段敲除，Western Blot检测不到GS蛋白信号，同时与野生型CHO-K1细胞和CHO FUT8-/-克隆相比 CHO FUT8-/-GS-/-存活率对培养基中谷氨酰胺具有十分强烈的依赖性。