【摘 要】
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目的:本课题拟在MCF-7、MDA-MB-231细胞中,研究雌二醇羟基代谢产物及羟基代谢酶谱的特征,以此探寻关键代谢酶及关键代谢产物在两种癌细胞发生发展中的作用,为乳腺癌的预防治
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目的:本课题拟在MCF-7、MDA-MB-231细胞中,研究雌二醇羟基代谢产物及羟基代谢酶谱的特征,以此探寻关键代谢酶及关键代谢产物在两种癌细胞发生发展中的作用,为乳腺癌的预防治疗,特别是三阴性乳腺癌的研究提供新思路;同时进一步阐明雌二醇代谢通路在乳腺癌发生发展中的作用,丰富雌激素致癌的机制。方法:(1)首先建立了细胞样本中雌二醇及其羟基代谢物的UPLC-MS/MS测定方法。(2)通过MTT法筛选雌二醇的给药浓度及时间,然后采用UPLC-MS/MS方法研究雌二醇在MCF-7、MDA-MB-231细胞中细胞药代动力学,包括雌二醇及其羟基代谢物在MCF-7、MDA-MB-231细胞中摄取及消除的情况。(3)最后采用RT-PCR和Western-blotting法检测了雌二醇在MCF-7、MDA-MB-231细胞中对CYP1A1和CYP1B1的基因和蛋白表达的影响,探讨雌激素的致癌机制。结果:本实验成功的建立了生物样本中雌二醇及其羟基代谢物的UPLC-MS/MS的测定方法,用于雌二醇及其羟基代谢物在MCF-7、MDA-MB-231细胞中摄取与消除研究。采用多反应监测,正离子扫描模式,以炔雌醇作为内标,雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇和炔雌醇的离子对质荷比分别为414.2/350.2、571.2/365.2、571.2/365.2、438.2/374.2,我们选用的离子模式为[M+H]~+。方法学的考察结果也符合指导原则的相关规定。采用MTT比色进行细胞的毒性实验,结果表明雌二醇浓度不大于1.0μM时,没有细胞毒性,考虑到后续实验及细胞状态,我们最终选取雌二醇的给药浓度梯度为0.4μM、0.8μM、1.0μM。雌二醇在MCF-7,MDA-MB-231细胞中的处置不尽相同,雌二醇浓度在0.4μM、0.8μM、1.0μM时摄取量呈剂量依赖性,并在两者细胞中24 h时药物浓度达到饱和,其中MCF-7细胞内的药物量远高于MDA-MB-231细胞,而生成的代谢物则不同,雌二醇在MCF-7细胞中主要代谢生成2-OH雌二醇,未能检测到4-OH雌二醇,而在MDA-MB-231细胞中则被主要代谢成4-OH雌二醇。药物清除实验结果显示,两种细胞均可以在12小时内清除雌二醇及其羟基代谢物。RT-PCR和Western-blotting实验检测低中高浓度的雌二醇对MCF-7、MDA-MB-231细胞中CYP1A1、CYP1B1基因和蛋白表达的影响,结果显示,在MCF-7细胞中,不同浓度的雌二醇(0.4μM、0.8μM、1.0μM)可以显著增加CYP1A1的基因和蛋白的表达,CYP1B1的基因和蛋白表达并无变化。而在MDA-MB-231细胞中与之相反,雌二醇给药后,上调了CYP1B1酶的基因和蛋白的表达。结论:雌二醇在雌激素受体阴性和阳性乳腺癌细胞中的羟基化代谢过程不同,雌二醇在MCF-7细胞中主要代谢物为2-OH雌二醇,在MDA-MB-231细胞中主要代谢物为4-OH雌二醇。低中高浓度的雌二醇均可以上调MCF-7细胞的CYP1A1的表达,此外MDA-MB-231细胞中CYP1B1的表达量显著上升,这可能与雌二醇致癌作用有关。本实验的研究结果可能为雌激素致癌的研究提供一定的理论基础。
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