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小球藻(Chlorella)是单细胞的真核绿藻。本实验室从南极中山站附近分离纯化到的一株小球藻NJ-18(Chlorella sp.NJ-18),能在4℃的低温下生长,同时也可以在20℃下生长。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是普遍存在于真核与原核生物中的一种抗氧化酶,它能够利用还原型谷胱甘肽(GSH)等作为还原剂,将细胞内的H2O2及脂质过氧化物还原成H2O或者相应的醇。目前有关南极微藻中抗氧化酶基因的克隆和鉴定报导不多。本文对南极小球藻NJ-18谷胱甘肽过氧化物酶基因gpx进行克隆,分析其在不同条件下的转录表达和酶活性。本文的主要研究内容和结果分为以下三个部分:
(1)NJ-18gpx的克隆及其在胁迫条件下的转录分析。通过简并PCR与RACE技术从南极小球藻NJ-18克隆了两个gpx cDNA全长序列,分别命名为NJ-18gpx2和NJ-18gpx3。NJ-18gpx2和NJ-18gpx3通过可变剪接的方式可分别形成3个和2个大小不同的转录本。荧光定量PCR的分析显示,在50μM中性红诱导的氧化胁迫下,NJ-18gpx3的转录水平在5小时内上调约4倍,而NJ-18gpx2的转录水平在5小时内没有显著变化；在0.5M NaCl诱导的盐胁迫下,NJ-18gpx2的转录水平在12小时内显著下调,约为对照的0.1,而NJ-18gpx3的转录水平在12小时内没有发生显著变化。
(2)NJ-18gpx所编码蛋白的原核表达及其在不同温度下的酶活性。在大肠杆菌E.coli中对NJ-18gpx所编码的蛋白进行了原核表达与纯化,在体外测定其酶活性,发现均能够利用硫氧还原蛋白(thioredoxin,Trx),而不能利用还原型谷胱甘肽作为电子供体,将不同类型的过氧化物还原。以温带莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中的CrGPX3蛋白为对照,在不同温度下测定了NJ-18GPX的酶活性,发现两者的酶学活性与温度之间的关系无明显差异。
(3)在集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803中过量表达NJ-18gpx3a。将NJ-18gpx3a基因整合到集胞藻PCC6803的pKW1188基因组平台上,在rbcL强启动子的驱动下,使其在PCC6803中能够过量表达。RT-PCR检测表明外源NJ-18gpx3a能够在转化子中成功的转录。转化子藻细胞粗提液中的GPX活性明显高于野生型。在胁迫条件下的生长测试表明,转化子相对野生型而言能够抵抗0.6mM H2O2诱导的氧化胁迫与1.0M NaCl的高盐胁迫。