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第一部分郑州地区5种食尸性苍蝇mtDNA中COⅡ基因序列的检测
目的:法医实践案例中有时需要用食尸性苍蝇及其幼虫、卵来推断死亡时间,但是用传统的形态学方法不能鉴定大多数食尸性苍蝇的幼虫和全部的卵。本研究取材郑州地区食尸性苍蝇及其幼虫,试用线粒体DNA上COⅡ基因637bp序列片段来解决种类鉴定问题,为法医实践提供方便,为推断死亡时间提供依据。
方法：4月～11月期间将SD大白鼠尸体放置在实验地点,观察尸体上食尸性苍蝇的群落组成与演替,采集野外的食尸性苍蝇的成虫和饲养的幼虫做样本,用酚-氯仿提取法和安瑞生等改进的小型昆虫DNA匀浆法提取样本的基因组DNA,通过UNⅡ型扩增仪进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,并寄往上海生工进行正反双向测序,用DNAMAN version.5.2.2和Clustalx-Raindy软件对测序结果进行比对、剪切,得出引物间的COⅡ基因序列,再用MEGA4.0软件对基因序列进行比对分析及构建系统进化树,并分析各种苍蝇COⅡ基因的碱基特征,探索其中的多态性。
结果：本实验时间段内,郑州地区主要有3科8种苍蝇出现在尸体上,分别是舍蝇、棕尾别麻蝇、大头金蝇、铜绿蝇、丝光绿蝇、巨尾阿丽蝇、亮绿蝇、开普黑蝇,各种苍蝇在尸体上出现的时间和演替表现出一定规律性。对5种26个苍蝇的COⅡ基因序列分析,得出各种苍蝇的遗传距离,通过对种内和种间进化分歧分析,巨尾阿丽蝇、亮绿蝇和棕尾别麻蝇的种内和种间进化分歧没有重叠现象,通过进化分歧分析能鉴定这3种苍蝇。对26个苍蝇用UPGMA法、NJ法和ME法构建三种系统进化树,由进化树可以鉴别巨尾阿丽蝇、亮绿蝇和棕尾别麻蝇三种食尸性苍蝇。通过进化分歧分析和系统进化树都不能将丝光绿蝇和铜绿蝇鉴别开。
结论：通过对郑州地区5种食尸性苍蝇mtDNA中COⅡ基因的637bp序列片段进行分析,可以发现不同种类食尸性苍蝇的基因序列碱基差异,计算出不同种类食尸性苍蝇的进化分歧和进化距离,构建系统进化树,能解决部分不易鉴定食尸性苍蝇的卵、幼虫、蛹种类的难题,此方法简便、快捷、准确,可以作为法医鉴定食尸性苍蝇种类的可靠依据,值得广泛推广和应用。
第二部分SNP在食尸性苍蝇种类鉴定中的应用
从Genbank数据库下载常见的棕尾别麻蝇、大头金蝇、巨尾阿丽蝇、亮绿蝇、铜绿蝇和丝光绿蝇6种食尸性苍蝇mtDNA上细胞色素氧化酶辅酶(CO)Ⅰ和Ⅱ基因序列,用Clustalx-Raindy和MEGA4.0软件对序列进行分析,寻找能鉴定种类的单核苷酸多态性(SNP)位点,结果显示棕尾别麻蝇、大头金蝇、巨尾阿丽蝇、亮绿蝇存在SNP位点。
小结:CoⅡ基因序列可以有效鉴定巨尾阿丽蝇、亮绿蝇和棕尾别麻蝇,不能鉴定丝光绿蝇和铜绿蝇；棕尾别麻蝇、大头金蝇、巨尾阿丽蝇、亮绿蝇存在SNP位点。