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研究背景：近年来儿童性发育异常问题逐渐增多，已引起儿童保健、内分泌专家及社会各界的关注。随着促性腺激素检测技术的发展，检测灵敏度、特异度和效能不断提高，目前第三代促性腺激素检测技术——免疫化学发光法临床应用广泛，其检测的尿促性腺激素(黄体生成素和卵泡刺激素)，在性发育异常儿童下丘脑-垂体-性腺轴评估中的临床应用研究价值凸显。与脉冲式分泌的血促性腺激素相比，尿促性腺激素可反映机体某一时段内血促性腺激素平均水平；与创伤性的反复多次血样采集方法相比，无创性的尿样采集方法，可明显提高患儿及家长的依从性。然而，在免疫化学发光法新技术检测的尿促性腺激素相关研究中，有关下丘脑-垂体-性腺轴启动儿童与青春期前正常儿童尿促性腺激素水平分析、从实验室寻找免疫化学发光法检测尿促性腺激素的新方法、及在人群中开展前期的预实验，探索上述新技术和新方法的可行性，相关研究资料甚少。 第一部分：下丘脑-垂体-性腺轴启动儿童尿促性腺激素分析 目的：分析下丘脑-垂体-性腺轴启动儿童的尿促性腺激素水平。方法：2009年8月至2016年8月期间，在小儿内分泌病房住院的儿童中，经促性腺激素释放激素类似物激发试验确诊为中枢性性早熟女童 50例，青春期男童38例、女童18例，均分别采集夜间12h尿和清晨血样；同期招募正常青春期前男童50例、女童49例，仅留取尿样。应用免疫化学发光法检测促性腺激素(黄体生成素和卵泡刺激素)，并测尿pH和尿肌酐。数据以中位数(最小值~最大值)表示。结果：(1)一般情况：中枢性性早熟女童、青春期男、女童的年龄分别为8.6(6.8~10.6)岁、12.1(9.9~15.6)岁和10.9(8.8~18.3)岁；正常青春期前男、女童的年龄均分别为 6.4(6.0~6.8)岁。(2)清晨血促性腺激素：中枢性性早熟女童血清黄体生成素、卵泡刺激素、黄体生成素与卵泡刺激素比值分别为0.95(0.10~17.70)IU/L、3.75(0.85~27.16)IU/L和0.236(0.030~2.462)；青春期男童分别为1.77(0.67~17.03)IU/L、3.82(2.11~18.83) IU/L和0.461(0.157~1.221)；青春期女童分别为1.27(0.28~22.99)IU/L、5.81 (2.15~8.78) IU/L和0.224(0.098~3.390)。(3)夜间尿促性腺激素：尿pH范围为5.0~7.0。中枢性性早熟女童黄体生成素含量、肌酐比、浓度、及卵泡刺激素含量、肌酐比、浓度、黄体生成素与卵泡刺激素比值分别为0.18(0.01~1.54)IU 、 67.811(9.333~1531.151)IU/mol 、 0.33(0.10~8.12)IU/L 、2.76(0.36~11.54)IU、1184.834(279.976~12018.220)IU/mol、5.435(0.75~40.75)IU/L 和0.072(0.010~0.261) ； 青 春 期 男 童 分 别 为 0.66(0.03~7.63)IU 、183.248(17.168~774.563)IU/mol 、 1.53(0.10~12.85)IU/L 、 3.62(0.15~19.04)IU 、1037.069(755.403~1932.489)IU/mol、7.23(7.48~32.06) IU/L和0.178(0.013~0.965)；青春 期 女 童 分 别 为 0.45(0.05~5.18)IU 、 167.008(2.990~1288.817)IU/mol 、1.18(0.10~35.46)IU/L 、 5.49(1.26~13.79)IU 、 1580.520(427.580~3432.848)IU/mol 、11.48(1.43~94.45)IU/L和0.090(0.019~0.375)；青春期前男童分别为0.03(0.01~0.08)IU、17.262(6.494~72.377)IU/mol 、 0.10(0.10~0.43)IU/L 、 0.70(0.18~1.91)IU 、451.507(104.113~2287.671)IU/mol、2.85(1.06~11.75)IU/L和0.037(0.009~0.094)；青春期 前 女 童 分 别 为 0.03(0.01~0.07)IU 、 19.834(6.488~103.316)IU/mol 、0.10(0.10~1.00)IU/L 、 1.46(0.03~4.66)IU 、 1196.499(26.376~2885.874)IU/mol 、6.24(0.20~30.21)IU/L和0.017(0.005~0.500)。(4)清晨血促性腺激素与夜间尿促性腺激素相关性：清晨血黄体生成素与夜间尿黄体生成素含量、肌酐比、浓度的相关系数分别为0.591、0.574和0.628，清晨血卵泡刺激素与夜间尿卵泡刺激素含量、肌酐比、浓度的相关系数分别为0.735、0.715和0.676，清晨血、夜间尿黄体生成素与卵泡刺激素比值的相关系数为0.288。(5)下丘脑-垂体-性腺轴启动儿童与正常青春期前儿童尿促性腺激素中位数比较：中枢性性早熟女童尿黄体生成素含量、肌酐比、浓度、尿卵泡刺激素含量、黄体生成素与卵泡刺激素比值均分别高于正常青春期前女童(P 均＜0.001)；青春期男童尿促性腺激素所有指标均分别高于正常青春期前男童(P 均＜0.001)；青春期女童尿促性腺激素所有指标也均分别高于正常青春期前女童(P 均＜0.001)。(6)尿促性腺激素判断儿童下丘脑-垂体-性腺轴启动的灵敏度和特异度：①在青春期男童中，当尿黄体生成素含量、肌酐比、浓度、及尿卵泡刺激素含量、肌酐比、浓度、及尿黄体生成素与尿卵泡刺激素比值分别≥0.09IU、44.540 IU/mol、0.29IU/L、1.98IU、633.455IU/mol、5.08IU/L和 0.087时，判断下丘脑-垂体-性腺轴启动的灵敏 度分别为97.4%、97.4%、97.4%、94.7%、84.2%、81.6%和92.1%，特异度分别为100.0%、98.0%、95.9%、100.0%、79.6%、85.7%和 98.0%。②在青春期女童中，当上述指标分别≥0.04IU、43.542 IU/mol、0.16IU/L、3.51IU、1341.354IU/mol、9.18IU/L和0.048时，其灵敏度分别为100.0%、88.9%、88.9%、77.8%、77.8%、72.2%和88.9%，特异度分别为91.8%、93.9%、93.9%、98.0%、57.1%、71.4%和87.8%。③在中枢性性早熟女童中，当上述指标分别≥0.04IU、46.283 IU/mol、0.15IU/L、2.46IU、2554.890IU/mol、17.86IU/L和0.031时，其灵敏度分别为94.0%、68.0%、70.0%、64.0%、14.0%、72.2%和92.0%，特异度分别为91.8%、93.9%、93.9%、83.7%、98.0%、93.9%和79.6%。④当尿黄体生成素含量≥0.06IU时，判断青春期男童、青春期女童、中枢性性早熟女童下丘脑-垂体-性腺轴启动的灵敏度分别为97.4%、94.4%和86.0%，特异度均为95.9%。结论：儿童夜间尿促性腺激素可反映其清晨血样水平，尤其夜间12h尿黄体生成素含量指标(≥0.06IU)可作为儿童下丘脑-垂体-性腺轴启动的重要参考指标之一。 第二部分：免疫化学发光法检测尿促性腺激素实验室方法学建立 目的：应用免疫化学发光法检测尿黄体生成素和卵泡刺激素，研究尿样不同参数(pH、渗透压和储存时间、防腐剂及冻融次数)对尿促性腺激素检测值的影响，旨在从实验室寻找免疫化学发光法检测尿促性腺激素的新方法。方法：收集新鲜过夜清晨尿，(1)pH：用盐酸或氢氧化钠分别滴定至2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和10.5。(2)渗透压：使用20%NaCL和去离子水分别调节至500、1000、1500、2000、2500和3000 mOsm/L。(3)储存时间：储存于4℃时，在第0 d ~7 d中每天检测1次，第2周末~第7周末每周检测1次。(4)防腐剂：即分别加入等量丙三醇或三蒸水。(5)冻融次数：自存放的第1天起，每天解冻1次直至第13次。在上述不同质控参数中，均采用免疫化学发光法检测尿促性腺激素。结果：(1)pH：在 pH2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和10.5尿样中，黄体生成素(IU/L)分别为1.828±0.055、1.918±0.111、1.895±0.058、1.850±0.142、1.805±0.077、1.765±0.069、1.748±0.072、1.758±0.068、1.738±0.060、1.738±0.057和1.735±0.085，各尿样的检测值与pH7.5时的尿样无显著性差异(P 均＞0.05)；卵泡刺激素(IU/L)分别为 0.905±0.074、5.827± 0.580、6.210±0.419、6.607±0.169、6.672±0.230、6.650±0.206、6.505±0.287、6.543±0.177、6.570±0.227、6.488±0.124 和 6.240±0.224；在 pH≥3.5 时，各尿样的检测值与 pH7.5时的尿样也无显著性差异(P 均＞0.05)，而在 pH2.5 时，尿卵泡刺激素检测值明显下降(t=71.940，P＜0.001)。(2)渗透压：原尿样(渗透压754.0±218.9 mOsm/L)、500 mOsm/L、1000 mOsm/L、1500 mOsm/L、2000 mOsm/L、2500 mOsm/L和3000 mOsm/L的黄体生成素(IU/L)分别为 0.582±0.257、0.654±0.314、0.606±0.301、0.516±0.202、0.495±0.218、0.439±0.186 和 0.425±0.183；卵泡刺激素分别为 3.161±1.937、3.267±1.993、3.186±1.855、3.063±1.835、3.035±1.806、2.928±1.686和2.928±1.663，各渗透压尿样的检测值与原尿样均无显著性差异(P均＞0.05)。(3)储存时间：第0 d ~7 d、第 2 周末~第 7 周末的尿黄体生成素(IU/L)分别为 1.765±0.026、1.765±0.072、1.675±0.067、1.675±0.075、1.605±0.031、1.665±0.076、1.622±0.053、1.562±0.034、1.527±0.137、1.637±0.085、1.365±0.058、1.433±0.076、1.428±0.085和1.368±0.060，与第0天相比，第1~3 天的尿黄体生成素均无显著性下降(t 分别为 0.000、3.087 和2.777 ，P 均＞0.05) ，从第 4 天后出现显著性下降；尿卵泡刺激素(IU/L)分别为5.375±0.149、5.305±0.153、5.248±0.164、5.317±0.224、5.093±0.110、5.303±0.173、5.042±0.099、5.032±0.280、5.035±0.115、5.035±0.125、5.163±0.205、5.318±0.167、5.423±0.188和5.055±0.181，与第0天相比，各尿样的检测值未呈显著性下降，P均＞0.05。(4)防腐剂：第0 d ~7 d、第2周末~第7周末的尿黄体生成素(IU/L)分别为1.600±0.040、1.568±0.082、1.677±0.038、1.623±0.061、1.470±0.034、1.553±0.023、1.495±0.029、1.497±0.046、1.380±0.046、1.403±0.045、1.207±0.054、1.248±0.044、1.130±0.037和1.038±0.021；与第0天相比，第1~3天的尿黄体生成素均无显著性下降(t分别为0.848、3.414和0.782，P均＞0.05)；尿卵泡刺激素(IU/L)分别为5.257±0.217、5.107±0.179、4.900±0.079、4.998±0.175、4.800±0.100、4.957±0.194、4.862±0.105、4.980±0.221、4.850±0.205、4.690±0.148、4.735±0.093、5.048±0.147、4.857±0.163和4.720±0.120，与第0天相比，在前2周末内结果与无防腐剂结果类似，第3周末、第4周末和第7周末，检测值呈现显著下降(t分别为5.279、5.409和5.304，P分别为0.025、0.039和0.032)。(5)冻融次数：原始尿样、第1至13次的尿黄体生成素(IU/L)分别为2.562±0.057、2.590±0.055、2.605±0.055、2.260±0.077、2.337±0.039、2.368±0.116、2.357±0.067、2.307±0.048、2.267±0.052、2.168±0.115、2.228±0.053、2.053±0.052、2.053±0.047和2.143±0.098，尿卵泡刺激素(IU/L)分别为9.747±0.567、9.403±0.448、9.093±0.309、9.628±0.394、9.463±0.314、9.308±0.112、9.470±0.221、9.483±0.276、9.203±0.359、9.225±0.316、9.698±0.219、9.183±0.268、9.795±0.450和9.253±0.252，冻融尿样解冻2次内的尿黄体生成素、各冻融尿卵泡刺激素均分别与原始尿样无显著性差异(P＞0.05)。结论：应用免疫化学发光法检测尿促性腺激素时，检测值不受生理范围内尿pH和渗透压波动的影响；尿样储存于4℃时，无需添加防腐剂，应在72 h内检测；储存于-20℃时，仅可冻融2次。 第三部分：学龄前儿童尿促性腺激素正常参考值的探讨 目的：为推崇免疫化学发光新技术检测尿促性腺激素及其实验室新方法，在学龄前儿童(3~6岁)中展开前期预实验，探讨学龄前儿童尿促性腺激素正常参考值。方法：在江苏省无锡市胡埭社区学龄前儿童中，经监护人知情同意后，依据年龄分成3岁~、4岁~、5岁~、6~7岁共4个年龄组。参照2006年世界卫生组织生长发育标准，进行体格发育评估，体块指数、年龄别身高Z评分和年龄别体重Z评分均符合＞-2SD且＜2SD者纳入研究对象；排除生长发育异常者。研究对象睡前排空膀胱，留取过夜清晨尿，记录留尿时段，应用免疫化学发光法检测尿促性腺激素，同时检测尿pH等。结果：(1)一般情况：在1248例儿童中，符合研究对象标准和尿液留取标准的共1105例，男、女童分别有585和520名；3~6岁组的男童分别有53名、208名、206名和118名，女童分别有37名、182名、167名和134名。尿pH范围为5.0~8.0。(2)尿促性腺激素：数据均呈非正态分布，正常参考值使用中位数(95%医学参考值范围)表示。①男、女童尿黄体生成素浓度分别为0.10IU/L (＜0.20IU/L)和0.10IU/L (＜0.31IU/L)，女童尿黄体生成素高于男童(Z =-3.755，P＜0.001)。男、女童尿卵泡刺激素浓度分别为2.54IU/L (＜7.96IU/L)和7.46IU/L (＜21.49IU/L)，女童尿卵泡刺激素明显高于男童(Z=-19.644，P＜0.001)。男、女童尿黄体生成素与卵泡刺激素比值分别为0.041(＜0.148)和0.016(＜0.068)，男童ULH/UFSH明显高于女童(Z=-19.506，P＜0.001)。②男童各年龄组UFSH浓度分别比较均无显著性差异(P=0.186)。女童各年龄组的UFSH 浓度呈显著性差异(P＜0.001)，其中，5岁组和6岁组UFSH浓度均分别较其3岁组低(χ2=10.96，P＜0.025；χ2=17.55，P＜0.005)，也均较其4岁组低(χ2=17.17，P＜0.005；χ2 =29.70，P＜0.005)。③男童各年龄组间的ULH/UFSH无显著性差异(P=0.262)。女童各年龄组的ULH/UFSH 呈显著性差异(P＜0.001)，其中，5 岁组和 6 岁组女童ULH/UFSH均低于其3岁组(χ2=17.54，P＜0.025；χ2=24.43，P＜0.025)，也低于其4岁组(χ2=14.13，P＜0.025；χ2=24.19，P＜0.025)。④在-2SD＜年龄别体重Z评分≤0SD儿童(短期营养状况差)中，尿黄体生成素浓度、尿卵泡刺激素浓度、尿黄体生成素与卵泡刺激素比值分别为0.10IU/L(＜0.26 IU/L)、4.45IU/L (＜17.11 IU/L)和0.026(＜0.111)；而在0SD＜年龄别体重Z评分＜2SD儿童(短期营养状况好)中，上述指标分别为0.10IU/L(＜0.27 IU/L)、3.60IU/L (＜17.71 IU/L)和0.029(＜0.125)，短期营养状况差与好的儿童尿黄体生成素浓度无显著性差异(Z=-0.472，P=0.637)，短期营养状况差的儿童尿卵泡刺激素浓度明显高于营养状况好者(Z=-1.991，P=0.046)，短期营养状况差的儿童尿黄体生成素与卵泡刺激素比值明显低于营养状况好者(Z =-2.337 ，P=0.019)。结论：学龄前儿童的尿促性腺激素正常参考值具有年龄和性别等特点；学龄前女童尿卵泡刺激素随年龄升高逐渐下降，6岁时趋缓；在短期营养状况差的儿童中，尿卵泡刺激素可升高；而长期营养状况则不影响尿卵泡刺激素。