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遗传变异是作物性状改良和分子育种的基础。基因组编辑技术是通过序列特异性核酸酶(sequence-specific nuclease，SSN)识别并切割靶位点，产生DNA双链断裂，进而对基因组定点修饰。常规植物基因组编辑技术主要是利用农杆菌或基因枪将SSN以DNA的形式转入植物细胞，并随机整合到植物基因组中，进而对基因组进行编辑。SSN表达框整合到植物基因组中会持续表达，增加脱靶效应。如何避免外源DNA的整合以及降低脱靶效应已成为植物基因组编辑在技术层面优化的两个重要目标。针对上述问题，本研究通过基因枪转化方法首次在小麦中建立了基于CRISPR/Cas9IVTs(in vitro transcripts)、CRISPR/Cas9RNPs(ribonucleoproteins)和TALEN蛋白的DNA-free基因组编辑体系。首先，建立了CRISPR/Cas9IVTs介导的基因组编辑体系，对两个内源基因（TaGW2和TaGASR7）进行编辑，突变效率均为1％左右。其中TaGW2基因在T0代即可获得六个等位基因同时发生编辑的纯合突变体，所占比例为35.3％。其次，建立了CRISPR/Cas9RNPs介导的基因组编辑体系，T0代TaGW2基因的突变效率可达到4.4％，与CRISPR/Cas9DNA的突变效率相当，且可以稳定遗传到下一代。实验结果表明CRISPR/Cas9RNPs可以显著降低脱靶效应，所有28株tagw2突变体植物即使在仅有一个碱基错配的脱靶位点处(TaGW2-A1)也没有检测到任何突变。CRISPR/Cas9RNPs介导的基因组编辑体系同时也在另一小麦品种YZ814中得到了进一步验证，TaGW2和TaGAR7两个基因T0代植物的突变效率分别为1.3％和1.8％。此外，我们还建立了TALEN蛋白介导的基因组编辑体系。利用体外纯化的TALEN蛋白对TaGW2和TaMLO两个基因进行了编辑，T0代植物突变效率分别为1.3％和0.4％。整个DNA-free基因组编辑的过程从基因组编辑材料的制备到最终不含外源DNA突变体的获得仅需9～11周。 植物基因组编辑技术飞速发展，如何快速准确的筛选植物突变体仍然是一个亟需面临的问题。本研究在六倍体小麦和二倍体水稻中，利用基于CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1RNPs进行后续突变体鉴定，建立了PCR/RNP的突变体筛选策略。PCR/RNP方法具有以下诸多优势:无需在靶位点处有可用的限制性内切酶位点，因而比PCR/RE的实用性更广，而且可以检测到没有破坏酶切位点的突变类型;比Sanger测序方法灵敏度更高而且更加廉价;比T7EI具有更高的准确度，可以有效区分纯合突变体和野生型。PCR/RNP方法尤其适用于上述小麦DNA-free基因组编辑体系，我们成功利用该方法对原生质体和T0代植物中gw2-TALEN蛋白诱导的突变进行了鉴定。此外，研究结果表明，基于高保真SpCas9变体或FnCpf1的PCR/RNP方法也可以用于单碱基突变的检测。 干旱是影响玉米产量的最重要非生物胁迫之一。本研究通过CRISPR/Cas9技术定点编辑ZmCer9L和ZmCer9S两个同源基因，创制了相应突变体并进行表型鉴定。冷冻扫描电镜和GC-MS实验结果表明纯合移码突变体zmcer9-1-49-35与野生型相比，其叶片细胞表面蜡质晶体结构发生变化，且含量显著升高，叶片明显加厚，提供了抗旱潜力。然而，zmcer9-1-49-35表现出明显矮化、结实率低等表型，影响其在抗旱育种中的应用。同时我们发现，含有一个非移码突变等位基因的玉米突变体zmcer9-7-3与野生型相比，叶片只有部分细胞表面蜡质密度降低，同时不影响植物生长。田间旱池实验表明:干旱条件下zmcer9-7-3突变体叶片卷曲程度降低，而且光合效率提升了大约20％。 综上所述，本研究在技术层面建立了小麦三种DNA-free基因组编辑体系和基于CRISPR/Cas9或Cpf1RNPs的突变体筛选策略;在应用层面对玉米Cer9基因进行定点改造，创制出新的玉米抗旱种质资源。以上研究可为今后的精准植物基因组编辑育种提供新的思路和技术支撑。