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研究背景角膜盲是临床上最常见的致盲性眼病之一,严重影响患者的视觉质量。角膜移植手术是治疗不可逆性角膜盲的最有效治疗方法。近年来,随着角膜移植免疫排斥和免疫耐受机制的不断研究,眼科显微外科技术的飞速发展,供体角膜组织保存技术的不断完善,使得角膜移植手术一年成功率高达90%以上。角膜移植手术是所有组织器官移植中成功率最高的手术之一,但是随着时间延长,排斥反应发生率可能会增加,尤其是伴随角膜新生血管、眼部碱化学伤、感染性角膜炎、多次角膜移植史等高危因素,这些都可能导致角膜移植排斥反应发生率增加。尽管角膜移植手术的成功率很高,但是角膜移植免疫排斥依然是角膜移植手术失败的主要原因之一。尽管目前已经有大量角膜移植免疫排斥机制研究,但是角膜移植排斥反应依然不能完全避免,因此,如何预防和治疗角膜移植排斥反应和诱导角膜移植免疫耐受仍然需要进一步研究。角膜移植排斥反应发生机制比较复杂,涉及多种因素。角膜移植排斥反应主要由宿主抗移植物反应引起,宿主体内抗原递呈细胞(antigen presention cells,APC)可以经血管网到达角膜植床,捕捉同种异体抗原后移行引流到下颌淋巴结和颈部淋巴结,在协同刺激因子的协助下,抗原递呈给T淋巴细胞,激活效应性T淋巴细胞,诱发间接免疫排斥反应,这是主要免疫排斥反应。另一方面,供体角膜植片来源的APC也可能被宿主抗原激活诱发直接免疫排斥反应,这是次要免疫排斥反应。因此,APC在角膜移植排斥反应中起着重要作用。APC主要包括树突状细胞(dendritic cells)和巨噬细胞,其中DC是抗原递呈功能最强的细胞,因此调控DC功能对于预防和治疗角膜移植免疫排斥反应具有重要作用。研究发现,Toll受体(Toll-like receptors, TLRs)广泛表达于眼表和DC细胞中,参与眼表各种炎症反应。其中髓样分化因子88((myeloid differentiation factor 88, MyD88)是TLRs受体家族中大部分成员接受抗原刺激信号转导到NF-κB的重要衔接蛋白。研究发现,Toll样受体2 (Toll-like receptor 2, TLR2)和NF-κB在糖皮质激素和免疫抑制剂环孢霉素A防治大鼠角膜移植免疫排斥中表达下降。髓样分化因子88((myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)基因敲出可以促进小鼠肾脏移植术后肾功能恢复和诱导免疫耐受。因此,我们推测MyD88依赖性NF-κB通路参与大鼠角膜移植免疫排斥反应,阻断TLRs信号通路下游的MyD88和核转录因子NF-κB表达对于研究如何预防角膜移植排斥反应和诱导角膜移植免疫耐受具有重要意义。根据前期研究和最新进展,我们发现MyD88依赖性NF-κB通路可能参与大鼠角膜移植免疫排斥反应。因此我们分别从关键靶点MyD88和NF-κB入手,研究分别下调眼局部和DC中两者表达在大鼠角膜移植排斥反应中的作用机制。这将有利于我们进一步明确MyD88依赖性NF-κB通路在防治大鼠角膜移植排斥反应中的作用机制。第一部分.NF-κB抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究研究目的探讨NF-κB抑制剂在大鼠穿透性角膜移植排斥反应中的作用机制。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型40只,随机分为四组：Isograft组、Allograft组、Dexamethasone组和PDTC组,术后第1天开始,Isograft组、Allograft组给予妥布霉素滴眼液,Dexamethasone组给予妥布霉素地塞米松滴眼液,PDTC组给予妥布霉素眼液与10mg/L PDTC滴眼液,1滴／次,4次／天,术后观察各组角膜植片排斥反应,进行RI(rejection index)评分和生存分析(survival analysis),术后15天行角膜组织HE染色和TNF-a免疫组化,RT-PCR检测角膜组织中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA表达,western blotting检测角膜组织中TLR2、MyD88和NF-κB P65蛋白表达量的变化。结果术后5、7、9、11、13和15天,Isograft组、Allograft组、PDTC组、Dexamethasone组,四组角膜植片RI比较具有统计学差异(F=257.705, P<0.001)。Allgraft组RI高于其余三组具有统计学差异(P<0.05)。PDTC组角膜植片生存时间中位数(median survival time, MST)(MST,23days, n=10),Isograft组(MST,19days, n=10), Allograft组(MST,14days, n=10)和Dexamethasone组(MST,25days,n=10),四组间角膜植片生存时间中位数比较具有统计学差异(χ2=66.491,P<0.001)。术后15天,Dexamethasone组和PDTC组角膜组织中TNF-a表达较Allograft组显著减少。术后15天,Dexamethasone组和PDTC组角膜植片中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA和蛋白质相对表达量显著少于Allograft组具有统计学差异(P<0.05)。结论Dexamethasone可以通过MyD88依赖性NF-κB通路抑制大鼠角膜移植排斥反应,PDTC可以通过抑制NF-κB活性抑制大鼠角膜移植排斥反应,MyD88依赖性NF-κB信号通路可以作为防治大鼠角膜移植排斥反应的重要调控通路。第二部分.MyD88抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用研究研究目的初步探讨MyD88抑制剂在大鼠角膜移植排斥反应中的作用。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型,随机分为三组：Allograft组,Dexamethasone组和MyD88抑制剂组,术后第1d开始,Allograft组给予妥布霉素滴眼液滴术眼,Dexamethasone组给予妥布霉素地塞米松滴眼液滴术眼,MyD88抑制剂组给予妥布霉素滴眼液与2mg/ml ST2825滴眼液滴术眼,1滴/次,4次/日,裂隙灯显微镜观察各组角膜植片排斥反应,进行角膜植片RI评分和生存分析。结果术后5、7、9、11、13和15天,Allograft组,Dexamethasone组和MyD88抑制剂组,三组间RI排斥指数比较具有统计学差异(F=91.870,P<0.05)。术后5、7、9、11、13和15天,Dexamethasone组和ST2825组的RI指数低于Allograft组具有统计学差异(P<0.05)。ST2825组与Dexamethasone组RI评分比较无统计学差异(P=0.458)。随着时间推移,各组角膜植片排斥指数均不断增加。Allograft组角膜植片生存时间中位数(median survival time, MST)(MST,13 days, n=6), ST2825组(MST,23 days, n=6)和Dexamethasone组(MST,24 days, n=6)。三组间生存时间比较具有统计学差异(χ2=24.110,P<0.001)。ST2825组和Dexamethasone组角膜植片生存时间中位数高于Allograft组具有统计学差异(χ2=12.230,P<0.001)。Dexamethasone组角膜植片生存时间中位数高于PDTC组无显著统计学差异(χ2=2.360,P=0.124)。结论MyD88特异性抑制剂ST2825短期内局部滴眼未见明显眼部毒副作用,其具有一定的抑制大鼠角膜移植免疫排斥的作用,可能与抑制角膜组织中MyD88表达相关。第三部分.树突状细胞中NF-κB在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究研究目的探讨Lv-siRNA-Rel-A转染大鼠髓源性DC在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用机制。研究方法(1).应用含5ng/ml粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与5ng/ml IL-4的RPMI-1640培养液诱导分化培养大鼠髓源性DC,流式细胞仪分析DC表面刺激分子CD86、MHC Ⅱ、OX62表达,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T淋巴细胞增殖能力。(2).应用高效抑制Rel-A表达的shRNA序列,构建Lv-siRNA-Rel-A载体,Western blotting验证其抑制Rel-A表达功能。将Lv-siRNA-Rel-A载体转染大鼠DC,应用Western blotting检测DC中Rel-A蛋白表达,流式细胞仪分析转染后DC表型分子CD80、CD86、MHC Ⅱ表达变化,MLR检测其刺激同种T细胞增殖能力。DC细胞转染后分四个实验组：A.空白对照组(细胞内不加任何干扰因素)；B.转染试剂对照组(转染不携带siRNA的空RNAi-Mate); C.阴性对照siRNA组(转染与目的基因序列无同源性的通用阴性对照,空载体组); D. Rel-A-siRNA组。Western blotting检测各组DC中Rel-A蛋白表达变化。(3).将负载供体抗原的2×106个培养第7d的Lv-shRNA-Rel-A DC于术前7d注入大鼠穿透性角膜移植模型中,实验分为六组：同种同体组,同种异体组,试剂转染组,DC组,空载体组,治疗组。术后裂隙灯显微镜观察角膜植片排斥情况,进行RI评分,Western blotting和RT-PCR检测大鼠角膜组织中TLR2、MyD88、NF-κBP65的蛋白和mRNA表达变化。结果(1). RPMI-1640含5ng/ml GM-CSF与5ng/ml IL-4的培养液可以获得足量大鼠髓源性DC,表达中等水平MHC Ⅱ和低水平CD86,刺激同种T细胞增殖能力低。共刺激分子MHC Ⅱ、CD86、OX62三组间具有统计学差异(F=969.213,P<0.001)。Day 9、12, DC表面MHC Ⅱ分子表达高于CD86(P=0.039)和低于OX62(P<0.001)具有统计学差异。CD86表达低于OX62(P<0.001)具有统计学差异。MHC Ⅱ、CD86、OX62表达阳性率随着培养时间延长逐渐增加,说明DC表型不断成熟,DC纯化程度越来越高,抗原递呈能力不断增强。(2).2.5×103DC组、5×103DC组、1×104DC组,三组间DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力差异具有统计学意义(F-23.889,P<0.05),其中2.5×103 DC组光吸收度A值低于5x103DC组(P=0.001)和1×104 DC组(P<0.001)具有统计学差异,5×103 DC组光吸收度A值低于1×104 DC组具有统计学差异昨0.008)。培养第12d,DC刺激同种异体T细胞的增殖能力显著增强。(3).构建Lv-siRNA-Rel-A慢病毒载体,RNA干扰组(Lv-siRNA-Rel-A转染DC组)大鼠DC中CD80,CD86的表达显著低于DC空载体对照组具有统计学差异(p<0.05),这说明siRNA-Rel-A可以降低DC表面刺激分子CD80、CD86的表达。RNA干扰组DC表面MHCⅡ分子表达下降不显著(P=0.080)。(4).空白对照组(A组)、转染试剂对照组(B组)、阴性siRNA对照组(C组)与Rel-A-siRNA组(D组),四组间DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力差异具有统计学意义(F=105.31,P<0.01);LPS刺激DC和Lv-siRNA-Rel-A转染DC后,LPS-siRNA-DC组刺激T细胞增殖能力较LPS-DC组弱具有统计学差异(P<0.05)。这说明Lv-siRNA-Rel-A转染DC可以降低其刺激同种T细胞增殖的能力。(5).空白对照组(A组)、试剂转染组(B组)、空载体组(C组)与siRNA-Rel-A组(D组),四组间Rel-A蛋白表达比较,siRNA-Rel-A组分别与空载体组和空白对照组比较,DC中Rel-A蛋白表达量显著下降(P<0.05)。(6).同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组,五组间角膜植片RI评分经球形检验(Mauchly’s Test of Sphericity), W=0.967,x2=0.642,P=0.725,接受球形假设。术后5d、10d、15d,五组间RI评分比较具有统计学差异(F=78.556,P<0.05)。治疗组RI评分低于同种异体组(P<0.05)具有统计学差异。治疗组与同种同体组比较无统计学差异(P=0.037)。随着时间推移,各组角膜植片排斥指数均不断增加。(7).术后15天,正常组、同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组,六个实验组中Rel-A蛋白相对表达量比较具有统计学差异(P<0.05),治疗组角膜组织中Rel-A蛋白表达下降,NF-κB活性下降。(8).正常角膜组织表达一定量TLR2与MyD88 mRNA。术后15天,正常组、同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组,六组间角膜组织中TLR2mRNA表达的差异倍数有显著性差异(F=27.807,P<0.001)。DC组中TLR2mRNA表达差异倍数显著低于同种异体组(P=0.029)。治疗组TLR2 mRNA表达差异倍数低于同种异体组(P=0.079)无统计学差异。术后15天,六组间角膜组织中MyD88 mRNA表达的差异倍数具有显著性差异(F=85.844,P<0.001)。DC组角膜组织中MyD88 mRNA表达差异倍数显著低于同种异体组(P=0.033)。治疗组MyD88 mRNA表达差异倍数低于同种异体组有统计学差异(P=0.044)。结论DC转染Lv-siRNA-Rel-A可以下调DC中Rel-A表达,降低DC表面CD80、CD86分子表达,维持未成熟化DC,抑制同种T淋巴细胞增殖反应。Lv-siRNA-Rel-A转染DC负载供体抗原后注入大鼠角膜移植体内,可以下调角膜组织中TLR2、MyD88、NF-κB(Rel-A)蛋白表达,延缓大鼠角膜移植排斥反应。MyD88依赖性NF-κB通路具有一定调控大鼠角膜移植免疫排斥的作用。