论文部分内容阅读
白细胞介素-24(IL-24)是在用干扰素和密植毒素处理人黑色素瘤细胞时利用差减杂交技术首次发现的。在恶性黑色素瘤中IL-24的表达量减少，在发生转移的黑色素瘤细胞中几乎检测不到IL-24的表达。研究表明，将含有IL-24基因的真核质粒或载有IL-24基因的腺病毒载体转染肿瘤细胞以过量表达IL-24时，可以诱导多种肿瘤细胞的凋亡，而在正常人上皮细胞或成纤维细胞中过量表达IL-24则对细胞的生长和活力几乎没有影响。除了能够特异性诱导肿瘤细胞凋亡，IL-24还能促进机体的抗肿瘤免疫反应、抑制血管生成、引起抗肿瘤旁路效应以及使肿瘤细胞对放化疗的敏感性增加。由于IL-24在动物移植瘤模型中良好的生长抑制活性和诱导肿瘤细胞凋亡的特性，针对腺病毒介导的IL-24(Ad.IL-24)的Ⅱ期临床试验在包括黑色素瘤在内的多种恶性肿瘤患者中展开。然而，腺病毒介导的基因治疗面临一些问题，包括对肿瘤细胞的特异性以及基因治疗本身的安全性等。因此，利用基因工程技术将IL-24进行重组表达对于IL-24的大规模生产及应用奠定了基础。本课题利用大肠杆菌表达系统高效制备了不同形式的重组IL-24蛋白，并检测其体内及体外抗肿瘤活性。通过对IL-24与抗凋亡蛋白survivin之间关系的研究，利用TAT-IL-24-KDEL和YM155对多种肿瘤细胞进行联合治疗。具体内容可分为以下几部分: (1)使用小分子样泛素化修饰蛋白(SUMO)融合表达系统制备重组蛋白IL-24在大肠杆菌中利用SUMO标签融合表达系统研究它对IL-24的表达量及可溶性的影响。虽然SUMO融合表达系统不能实现IL-24的可溶性表达，但是在蛋白质复性过程中极大的提高了IL-24的复性率。复性成功后，利用SUMO蛋白酶对融合蛋白SUMO-IL-24进行酶切以获得重组蛋白IL-24，每升发酵液中可以得到25 mg IL-24纯蛋白。体外抗肿瘤活性检测表明，重组蛋白IL-24能够抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，说明利用SUMO融合表达系统能够大量制备具有生物活性的重组蛋白IL-24。 (2)定位在内质网上的重组融合蛋白TAT-IL-24-KDEL诱导肿瘤细胞凋亡的研究通过大肠杆菌表达系统，构建、表达和纯化了一种能够穿过细胞膜并且定位在内质网上的重组融合蛋白TAT-IL-24-KDEL。转录反式激活因子的定位区域（TAT）和内质网滞留信号肽KDEL分别连接在IL-24的N端和C端。体外实验表明TAT-IL-24-KDEL抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，而对正常细胞没有影响。通过Western blot实验表明TAT-IL-24-KDEL通过内质网压力介导的细胞死亡途径来诱导肿瘤细胞凋亡。TAT-IL-24-KDEL能够显著抑制人肺癌细胞H460裸鼠移植瘤的生长，组织切片H&E染色和TUNEL染色表明TAT-IL-24-KDEL促进肿瘤细胞的坏死和凋亡。说明人工设计的靶向性重组蛋白TAT-IL-24-KDEL在肿瘤治疗方面具有较好的应用潜力。 (3) IL-24与抗凋亡蛋白survivin调节肿瘤细胞凋亡的机制在利用重组融合蛋白TAT-IL-24-KDEL诱导肿瘤细胞凋亡时，抑制抗凋亡蛋白survivin的表达可以增强TAT-IL-24-KDEL介导的内质网压力效应。在肿瘤细胞中利用真核质粒过量表达survivin时阻断了TAT-IL-24-KDEL对肿瘤细胞的杀伤作用，而利用siRNA干扰survivin的表达时使被转化细胞对TAT-IL-24-KDEL的杀伤作用更加敏感。TAT-IL-24-KDEL与survivin的小分子抑制剂YM155联合治疗后，能够更加强烈的激活内质网压力以及线粒体功能紊乱，更加显著的抑制裸鼠移植瘤的生长，抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成，促进肿瘤细胞的凋亡和坏死。 (4)使用MBP-SUMO双标签融合表达系统使IL-24可溶性表达 充分利用MBP和SUMO融合表达标签各自的优势，构建了新的双标签融合蛋白MBP-SUMO-IL-24。MBP-SUMO-IL-24在大肠杆菌中以可溶形式表达，经Ni离子亲和层析柱纯化后，用SUMO蛋白酶在SUMO/IL-24连接处将IL-24从融合蛋白上释放出来。SUMO蛋白N末端的His6标签使IL-24可以通过柱上酶切的方法进行一步纯化，提高纯化效率，减少蛋白损失。最后，每升发酵液中可以获得32 mg IL-24纯蛋白。体外实验表明，可溶表达的重组蛋白IL-24能够诱导人膀胱癌细胞的凋亡而对正常细胞没有影响。 本课题阐述了一种利用大肠杆菌表达系统制备重组蛋白IL-24的新方法，设计了一种能够穿过细胞膜并且定位在内质网上的重组融合蛋白TAT-IL-24-KDEL，通过内质网压力介导的细胞凋亡途径更加强烈的诱导肿瘤细胞凋亡。TAT-IL-24-KDEL在体内和体外实验中均表现出良好的抗肿瘤活性。利用TAT-IL-24-KDEL与survivin抑制剂YM155联合治疗时相比于单独治疗更加强烈的抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡。另外，本课题利用MBP-SUMO双标签融合表达系统实现了重组蛋白IL-24的可溶表达。