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目的：(1)利用流式细胞仪检测表皮细胞整合素β1亚基(CD29)和增殖细胞核抗原(PCNA)的荧光标记强度，建立简便易行的表皮干细胞检测方法。(2)利用该检测手段，通过优化表皮细胞分离、培养条件，以提高培养表皮细胞中的干细胞数量。(3)构建人整合素β1基因重组腺病毒载体，转染表皮细胞，观察其生物学特征的改变，为进一步皮肤组织工程研究提供理论基础和研究手段。方法：(1)分离表皮细胞，通过粘附选择富集表皮干细胞和短暂扩充细胞，观察细胞克隆形成率，流式细胞仪检测表皮细胞CD29和PCNA、荧光免疫组织化学检测BrdU的荧光标记强度，分析上述指标间的相关性。(2)利用L16(4~4)正交表设计试验，选择原代培养消化过程中Dispase Ⅱ酶与胰蛋白酶不同浓度和作用时间，以及无血清培养基中EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松的不同浓度为实验因素，考察表皮细胞生物学性状和其中CD29~+／PCNA~-细胞的比例，优化最佳分离和培养条件。(3)利用AdeasyTM系统构建含ITG-β1基因片段的重组腺病毒载体，转染人原代培养表皮细胞，观察细胞克隆形成率和CD29~+／PCNA~-细胞的比例。结果：(1)快速粘附细胞群中CD29~+／PCNA~-细胞的比例约为67.33％，BrdU阳性率为58.57％，S期细胞比例2.95％；而粘附较慢的细胞群中以上指标分别为14.29％、9.84％和16.65％。经相关分析，CD29~+PCNA~-细胞的比例与BrdU阳性率及细胞周期分析间具有良好的相关性(r=0.94，0.87)。(2)胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对表皮细胞24 h贴壁率有显著影响，后者更显著影响了克隆形成率和干细胞比例。0.125％ Dispase Ⅱ酶冷消化10h，0.1％胰蛋白酶37℃消化30min，分离的原代表皮细胞中干细胞比例最高，克隆形成率也最高。无血清培养体系中，EGF在对培养人表皮细胞的增殖有显著促进作用，随浓度提高而效应加强。胰岛素、霍乱毒素浓度对培养细胞的增殖也有影响，氢化考的松作用不显著。EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松分别取20ng／ml、5μg／ml、8.4ng／ml、0.2μg／ml浓度时细胞生长及增殖最佳。(3)成功构建了37kb的携带ITG-β1基因的重组腺病毒载体pAd ITG-β1，大小与预计结果相符，并转染原代培养的表皮细胞。转入ITG-β1基因组细胞的克隆形成率显著高于对照组(25.53％vs.7.46％，P＜0.01)，CD29~+／PCNA~-细胞比例两组间也有显著差异(17.53％vs 7.92％，P＜0.01)。结论：(1)CD29~+PCNA~- 细胞比例与鉴定干细胞的基本指标BrdU阳性率及细胞周期均具有良好的相关 性，可以作为表皮干细胞的检测指标。o）对于原代表皮细胞分离培养，0．125％ Dispase 11酶冷消化 10 h，0．l％胰蛋白酶 37℃消化 30 min，培养体系中 EGF、 胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松分别取 20 ＂g／Inl、5 112，Illl、8．4 ＂g／llil、0．2 gb浓度时，原代表皮细胞中干细胞比例最高。o）成功构建了携带ITG乃 基因片段的重组腺病毒载体，转染人表皮细胞后，能增强细胞的增殖能力，增 加表皮细胞内干细胞比例。