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目的:
RACK1(receptor for activated C kinase1)为有活性的蛋白激酶C受体。蛋白激酶C的激活依赖于RACK1蛋白。RACK1的功能并不局限于PKC通路，作为支架蛋白及适应蛋白，通过不同的WD40位点，与细胞内多种蛋白相互作用，参与细胞功能调控。微小染色体维持蛋白复合体(MCM)为DNA复制执照系统成员之一，在真核细胞的DNA复制起始调控中起重要作用，MCM7为该复合体的重要成分，并对维持MCM复合体的螺旋酶活性有重要意义，在控制DNA复制的过程中起关键作用。
本文在肺大细胞癌细胞系H460及肺腺癌细胞系A549中干扰RACK1，或者瞬时转染pCMV-sport6-RACK1，MTT、集落形成实验、流式细胞术检测RACK1在肺癌细胞中的功能；免疫共沉淀和免疫荧光双重染色激光共聚焦实验证实MCM7与RACK1的直接作用，探讨可能存在的作用机制。
方法:
1、细胞培养
肺大细胞癌细胞系H460及肺腺癌细胞系A549购自ATCC。在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培养(37℃，5％CO2)。
2、质粒转染与RNAi
用含有10％胎牛血清的1640培养基培养肺大细胞癌细胞系H460及肺腺癌细胞系A549，接种16～18h后，按照Lipofectamine2000使用说明完成细胞瞬时转染及干扰。
3、Western blot
收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上，然后用5％BSA封闭，4℃一抗过夜，二抗37℃孵育2小时后ECL发光。蛋白条带经BioImaging Systems(UVP,CA，USA)采集后进行灰度值测定，目的蛋白灰度值与内对照β-actin进行标准化后即为其相对蛋白定量。
4、四亚基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖
将转染／干扰后24小时的肺癌细胞悬液进行细胞计数，分别接种于五个96孔板。分别于第24，48，72，96，120小时加入MTT（5mg/ml）20μl，继续孵育4小时后，每孔加入DMSO150μl溶解结晶，选择波长490nm在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。
5、集落形成实验
将转染／干扰后24小时的肺癌细胞悬液进行细胞计数，制成300～1000活细胞/mL的细胞悬液，然后移培养板于CO2培养箱中37℃进行培养，培养10天，用结晶紫染色观察并计数细胞集落。
6、流式细胞仪检测细胞周期
将转染／干扰后48小时的肺癌细胞悬液进行细胞计数，制成1x107个/ml细胞悬液，75％乙醇固定过夜、离心后制成500μL的细胞悬液，加入0.5毫升碘化丙啶(PD染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min后上机检测。
7、免疫共沉淀
提取的蛋白裂解液中加入1μg的诱饵蛋白抗体，充分混匀后4℃孵育2小时，再加入40μl protein A/G琼脂糖珠4℃孵育过夜，按照操作说明，收集免疫沉淀复合物，行Western blot分析。
8、免疫荧光双重染色激光共聚焦细胞内共定位
4％多聚甲醛固定1小时，PBS洗2次，10％血清及0.4％Triton X-100 PBS封闭。MCM7单克隆抗体(1:500)、RACK1多克隆抗体(1:500)孵育，4℃过夜。PBS洗2次，牛抗鼠二抗(FITC标记，1:2000)和羊抗兔二抗(TRITC标记，1:2000)室温孵育1小时。PBS洗2次，DAPI复染核，PBS洗，封片，共聚焦显微镜观察。
9、统计学分析
所有实验重复三次，实验数据用(x)±s表示，采用单因素方差分析利用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，p＜0.05为差异具有统计学意义。
结果:
在肺大细胞癌细胞系H460及肺腺癌细胞系A549中，特异性干扰RACK1后细胞增殖能力明显降低，MTT法结果显示，细胞倍增时间明显减少，集落形成实验显示集落生成数明显下降，增殖能力降低，流式细胞术显示PI下降，S期比例下降；转染pCMV-sport6-RACK1后细胞增殖能力升高，细胞倍增时间增加，集落生成数升高，S期比例升高。
免疫共沉淀在肺癌细胞内证实两种蛋白的相互作用，蛋白RACK1能够在MCM7抗体的免疫复合物中检测出来，而在阴性对照IgG中未能检测出来，同理，蛋白MCM7能够在RACK1抗体的免疫复合物中检测出来，说明MCM7和RACK1可以在细胞内特异性结合；免疫荧光双重染色激光共聚焦显微镜观察发现，FITC-MCM7绿色荧光定位于细胞核，TRITC-RACK1定位弥散于细胞浆，在细胞核中也有点状表达，两者共同定位于细胞核。进一步探讨RACK1对MCM7功能的影响，在肺腺癌细胞系A549干扰RACK1或瞬时转染pCMV-sport6-RACK1后，MCM7的蛋白表达量没有明显变化；MCM7沉淀复合物，抗磷酸化丝氨酸及苏氨酸抗体检测的结果表明RACK1在丝氨酸位点及苏氨酸位点磷酸化MCM7。
结论:
1、首次证明RACK1能够促进肺癌细胞增殖
2、首次证明RACK1与MCM7直接结合
3、首次证明RACK1能够磷酸化MCM7