论文部分内容阅读
子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs),简称内异症,定义为子宫内膜样组织在宫腔以外部分异常生长。内异症在育龄期妇女中的发病率约为10%,常常引起女性的慢性盆腔痛和不孕。随着越来越多疾病相关的分子机制被阐明,临床和基础研究对内异症的关注点也从单一病灶到了复杂的系统性病变。根据异位内膜病灶发病部位的不同,主要分为三类内异：生长于盆腔浅表腹膜(腹膜型内异),位于直肠子宫陷凹且通常混合脂肪和纤维肌性组织(直肠子宫凹内异结节),内膜样粘膜附于卵巢囊肿(卵巢内异囊肿)。这三种临床分型可能是由于不同的细胞分子机制也可能是同一种病理过程的不同结局。尽管已有一些理论和假设被提出和论证,然而内异症确切的发病机理至今不明。肝再生磷酸酶3(Phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员,其羟基端异戊烯化位点决定了该蛋白的功能和细胞内定位。过表达的PRL-3最早被发现与结肠癌细胞的转移性相关。过去的十几年中,在许多妇科的恶性疾病中也发现了PRL-3的高表达,如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和内膜癌。研究发现在不同来源的细胞中,PRL-3可以调节Rho家族GTP酶或者JAK2/STAT3通路,强化恶性细胞增殖和迁移侵袭的能力。内异症虽是良性的妇科疾病,但具有一些恶性肿瘤的生物学行为,如增殖、侵袭和复发等。我们在前期研究中阐述了PRL-3表达增加和内异症的疾病进展和高复发率相关,提示PRL-3在内异症的疾病进展中起了一定的作用。然而,PRL-3在内异症中的具体发病机制至今未知。两面神激酶(janus kinase, JAK)/信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)是重要的信号通路之一,在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移侵袭和血管生成中被广泛研究。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是该负反馈环的一部分,可抑制JAK/STAT信号通路。在一些恶性肿瘤细胞中发现有异常或持续的STAT3磷酸化伴随SOCS3表达下降：反过来,SOCS3在这些细胞中过表达可减少STAT3的活性。我们的前期研究已经通过免疫组化证明了SOCS3在卵巢异位内膜的表达明显低于在位内膜。本次研究的目的是检测和比较PRL-3和SOCS3在非内异症女性的子宫内膜(EuCo)、卵巢异位囊肿患者在位(EuEM)和异位(OvEM)的内膜间质细胞(endometrial stromal cells, ESCs),研究PRL-3对内异症的细胞骨架重构、细胞迁移侵袭的作用,然后分析SOCS3/JAK2/STAT3通路的激活及其与PRL-3的相互作用并探索相关的细胞分子机制。第一部分PRL-3在不同内膜间质细胞的表达目的：研究PRL-3在对照组即非内异症女性的子宫内膜(EuCo)、内异症的在位内膜(EuEM)和卵巢型异位内膜(OvEM)的原代间质细胞(ESCs)以及PRL-3在月经周期中的表达波动。方法：临床取材新鲜的EuCo、EuEM和OvEM,培养原代细胞,并提纯分离出ESCs;用免疫荧光检测间质细胞的纯度；用western blot检测比较三组细胞增殖期和分泌期PRL-3的蛋白表达情况；用RT-qPCR检测比较三组细胞增殖期和分泌期PRL-3的mRNA表达情况。结果：1. 成功分离纯化和培养原代非内异症的子宫内膜间质细胞(CoESCs)、内异症患者在位内膜间质细胞(EuESCs)以及内异症患者卵巢型异位内膜间质细胞(OvESCs)。2. 三组细胞形态相似、呈长条梭形,状态稳定,可传代。3.PRL-3蛋白和mRNA的表达在OvESCs组中均显著高于CoESCs组和EuESCs组,而EuESCs组和CoESCs组间并无显著差异。4.三组中PRL-3的蛋白和mRNA表达均与月经周期无明显相关性。结论：1.原代培养的ESCs为内异症的基础研究提供了较为理想的体外模型。2. 高表达的PRL-3和内异症的发生发展可能有一定的相关性。3.PRL-3和内异症的激素依赖性可能没有相关性。第二部分高表达的PRL-3促进异位内膜间质细胞的细胞骨架重塑、提高细胞迁移侵袭能力目的：探索PRL-3对在位和异位内膜间质细胞的细胞骨架及运动活性的影响和作用机制。方法：原代培养卵巢型异位内膜间质细胞(OvESCs),用小干扰RNA(siRNA-PRL-3)瞬时转染OvESCs或者绿色荧光慢病毒包被的短发卡RNA(LV-GFP-shRNA-PRL-3)稳定感染OvESCs来抑制PRL-3的表达；原代培养内异症患者的在位内膜间质细胞(EuESCs),构建质粒过表达载体(pCEP4-PRL-3)并稳定转染EuESCs使其过表达PRL-3；用western blot检测比较各组细胞的蛋白表达情况；用RT-qPCR检测比较各组细胞的mRNA表达情况；免疫荧光检测处理后细胞的骨架形态以及肌动蛋白和微管蛋白的分布情况；WST1法检测处理后细胞的增殖变化；Transwell细胞迁移侵袭实验检测处理后细胞的运动活性。结果：1. 内源性抑制PRL-3的表达可显著改变OvESCs的细胞骨架以及肌动蛋白和微管蛋白的分布,并且抑制了细胞骨架相关的Rho同源基因家族RhoA、RhoC、ROCK1蛋白和mRNA的表达。2.PRL-3表达抑制后,OvESCs增殖能力不变,迁移及侵袭能力均下降,其中MMP9蛋白水平下降,而MMP2没有明显变化。3. EuESCs过表达PRL-3可上调RhoA、RhoC、ROCK1蛋白和mRNA的表达。4.PRL-3过表达后,EuESCs增殖能力不变,迁移及侵袭能力均增加,其中MMP9蛋白水平上升,且MMP2没有明显变化。其中ROCK1和MMP9抑制剂均可阻断PRL-3对细胞迁徙侵袭的促进作用。结论：1.PRL-3的表达影响内异症患者内膜间质细胞(ESCs)的细胞骨架结构,可双向调节RhoA/RhoC/ROCK1通路的分子水平。2.PRL-3和ESCs的增殖能力无明显相关性。3.PRL-3可通过Rho家族和MMP9而非MMP2影响ESCs细胞迁移侵袭能力。第三部分PRL-3抑制剂对活体内异模型的异位病灶的作用目的：建立子宫内膜异位症动物模型；探索PRL-3抑制剂对活体异位病灶的影响。方法：21只雌性SCID小鼠,移植人子宫内膜至其腹壁造模；40只雌性SD大鼠,自体子宫内膜移植至腹壁造模；免疫组化验证病灶内膜的上皮及间质组织；内异动物模型腹腔注射PRL-3抑制剂,处理后分析比较处理前后各组病灶情况。结果：1.SCID小鼠人内膜移植模型建模存活率为72.2%,存活小鼠的造模成功率为59.0%。2. SCID小鼠造模并用药后,PRL-3抑制剂高剂量组病灶明显小于对照组和低剂量组,后两者间无明显差异。3.SD大鼠自体子宫内膜移植建模存活率为86.1%,存活大鼠的造模成功率为92.5%。4.SD大鼠各组处理后对比处理前,对照组病灶明显增大,低剂量组和中剂量组病灶大小没有明显变化,高剂量组病灶显著缩小。结论：1. SD大鼠内异模型可用于内异症的活体研究,是一种操作性强、重复性好且成本低的内异症模型。2. 高剂量(1mg/kg/day)的PRL-3抑制剂可明显抑制SCID小鼠体内的人内膜异位病灶的生长。3. 高剂量(2mg/kg/day)的PRL-3抑制剂可明显抑制SD大鼠自体内膜异位病灶的生长。第四部分PRL-3参与的SOCS3/JAK2/STAT3通路在异位内膜间质细胞中的作用和机制研究目的：检测原代CoESCs、EuESCs和OvESCs中SOCS3和pSTAT3的表达差异；研究PRL-3与SOCS3/JAK2/STAT3在内异中的相互影响和作用机制。方法：原代培养CoESCs、EuESCs和OvESCs;用小干扰RNA (siRNA-Ctrl/ siRNA-PRL-3)转染OvESCs同时用绿色荧光慢病毒系统(LV-GFP-Ctrl/ LV-GFP-SOCS3)感染OvESCs外源性使其降调PRL-3且/或过表达SOCS3;用western blot检测各组蛋白的表达情况；用RT-qPCR检测比较各组mRNA的表达情况；流式细胞术检测四组细胞凋亡水平和细胞周期；WST1法检测四组细胞的增殖变化；Transwell细胞迁徙侵袭实验检测四组细胞的运动活性。结果：1. OvESCs组中SOCS3蛋白和mRNA的表达显著高于、而STAT3的磷酸化水平明显低于CoESCs组和EuESCs组,且两者在EuESCs和CoESCs并无显著差异。2. OvESCs外源性过表达SOCS3后,JAK2的磷酸化水平不变,STAT3的磷酸化明显抑制；且过表达后只有在同时抑制PRL-3的表达时JAK2的磷酸化水平下降。3. 过表达SOCS3或者降调PRL-3都可以导致细胞凋亡率明显上升；PRL-3本身不会影响细胞周期和细胞增殖,但抑制PRL-3表达可以强化过表达SOCS3所引起的细胞周期G0G1期的细胞增加、S期和G2M期的细胞减少,以及细胞增殖水平的下降。4.外源性过表达SOCS3可叠加内源性抑制PRL-3导致的细胞迁移侵袭能力下降及MMP9蛋白水平下降；对RhoA/RhoC/ROCK1通路和MMP2的表达并无明显变化。结论：1.SOCS3的低表达以及STAT3的过磷酸化和内异症的发生发展可能有一定的相关性。2. 内异细胞的凋亡水平下降而细胞增殖水平上升可能和OvESCs的SOCS3低表达有关,而OvESCs本身高表达的PRL-3可能通过增加JAK2的磷酸化而强化这种作用。3.异位内膜细胞中SOCS3的表达下降或缺失可能通过增加MMP9的蛋白水平而强化PRL-3对细胞迁移侵袭的促进作用。