论文部分内容阅读
脂筏(lipid rafts)是细胞质膜上富含固醇类和鞘脂类的微结构域,其大小为10-200 nm,它还是一种高度动态的结构。脂筏微区富含GPI(glycosylphosphatidylinositol)锚定蛋白以及caveolin,flotillin等膜整合蛋白。脂筏具有许多重要的生物学功能,其中包括参与信号转导、跨膜转运、胞吞和胞吐平衡调节,细胞骨架组织以及病原菌入侵等。目前有关脂筏在植物细胞学中的研究主要集中在对一些蛋白和脂类成分的分析鉴定上,而缺乏对其功能和分子机制的研究。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为材料,运用分子生物学和细胞生物学的方法,对脂筏标记蛋白flotillin1(AtFlotl)的定位和功能进行分析研究,以阐明脂筏在胞吞过程中的作用机制,并为进一步揭示植物细胞中脂筏作用的分子机理提供理论参考。
本研究利用原核体系表达了AtFlotl蛋白,以纯化的蛋白为抗原,制备了多克隆和单克隆抗体。通过免疫印迹实验显示,免疫前血清未检测出任何信号,而单克隆抗体则在拟南芥质膜和脂筏组分上均检测出了杂交信号,表明抗体的特异性较好,可以用来检测内源性AtFlotl蛋白的定位。克隆了AtFlotl基因,并构建了GFP标记的稳定表达载体,获得了转基因拟南芥植株。通过激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察,该蛋白主要定位于细胞质膜和胞内一些点状结构上,并与FM4-64共定位,由此表明,细胞内的这些点状结构很可能是内涵体,暗示AtFlotl可能与胞吞作用有关。通过免疫胶体金实验结果进一步验证了AtFlotl蛋白的定位,并发现金颗粒标记的囊泡直径为101.35±12.72nm。此外,在高压冷冻电镜下,我们也观测到了AtFlotl参与囊泡形成过程的形态学证据。以上结果表明,AtFlotl蛋白可能参与胞吞囊泡形成及其随后的胞吞过程。在拟南芥根细胞中,运用隐失波显微镜技术(evanescent wave microscopy,EWM)检测到由GFP-AtFlotl形成的高度动态的荧光点,并且可以进行连续的胞吞运动。通过比较两种类型囊泡的动力学特征,结果发现,AtFlotl标记的囊泡的平均运动速率比笼形蛋白包被小泡(clathrin coated vesicle,CCV)的更高,而扩散系数则较小,由此可以根据这两种类型的囊泡的动力学参数进行有效区分。另外,通过荧光共定位和免疫胶体金标记实验,我们还发现,AtFlotl蛋白与笼形蛋白轻链(clathrin light chain,CLC)不存在明显的共定位关系,因而两者的分布是相对独立的。上述结果说明,AtFlotl蛋白介导一种不依赖于笼形蛋白(clathrin)的新型胞吞途径。、通过利用人工小RNA干扰技术(artificial microRNA interference,amiRNAi)降低AtFlotl蛋白的表达水平后,转基因株系显示出生长缺陷的表型,如生长变慢、株型变小,茎的顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)比野生型植株小,根的分生组织(root meristem,PM)细胞数量约为野生型植株的67.19％。这些结果表明,AtFlotl蛋白在拟南芥的生长发育中具有重要作用。总之,通过上述研究揭示：⑴AtFlotl蛋白参与胞吞囊泡形成及其随后的胞吞过程；⑵遗传学和细胞学实验分析表明,AtFlotl蛋白介导的胞吞途径与经典的clathrin介导的胞吞途径不同；⑶降低AtFlotl蛋白的表达水平,从而使得拟南芥的生长发育受到阻滞。由此我们认为,拟南芥AtFlotl蛋白介导一种不依赖于clathrin的胞吞途径,而且这种途径对植物的生长发育具有重要作用。