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前言 视网膜母细胞瘤(Rb)是发生在视网膜的恶性肿瘤。1987年Dyyja和Weinberg两个小组共同研究，克隆成功Rb基因。当初推测Rb基因仅与视网膜的发生与分化有关，是视网膜母细胞瘤的致病基因。以后发现，Rb基因在所有体细胞均有大量表达，提示Rb基因具有更普遍的生理功能。近年的研究证明，骨肉瘤，肺癌，乳腺癌，膀胱癌，前列腺癌等均可见到Rb基因异常，提示Rb基因是人体非常重要的抑癌基因之一。 Rb基因位于人类染色体13q14，编码105Kd的蛋白质(pRb)。pRb与转录因子E2F结合，抑制E2F依赖性的增殖相关分子的表达，控制细胞的增殖。pRb与E2F的结合受pRb磷酸化状态的调节。低磷酸化型pRb易与E2F结合，结果使细胞停滞在G1期。增殖信号传入细胞后，G1期cyclin表达，pRb被cyclinD／CDK4／6磷酸化，变成高磷酸化型，失去结合E2F的能力，E2F游离激活。游离型E2F对cyclin等发挥转录调节活性，使细胞由G1期进入S期。引起pRb发生细胞周期依赖性磷酸化的激酶主要是cyclin D／CDK4(或CDK6)及cyclin E／CDK 2复合物。近年来的研究发现，许多基因通过信号传导途径调节pRb发生细胞周期依赖性磷酸化。其中被广泛研究的是p16-cyclin／CDK-Rb途径和p53-p21-cyclin／CDK-Rb途径。p16和p21是cyclin／CDK4／6的特异性抑制因子，通过cyclin-CDK4／6调节pRb磷酸化状态，控制细胞周期进行。 关于Rb基因家族及其传导途径异常与肿瘤的关系，许多研究证明，约20％的恶性肿瘤存在Rb异常，80％的肿瘤存在p16-cyclin／CDK-Rb途径或p53-p21-cyclin／CDK-Rb途径中某一环节的异常。在小细胞肺癌(SCLC)约90％，非小细胞肺癌(NSCLC)约10-30％存在Rb基因异常，Rb基因异常者因肺癌死亡的危险性比正常人高15倍，是肺癌发生的遗传因素之一。在小细胞肺癌中，pRb与细胞的恶性程度，临床分期，淋巴结转移等反映疾病预后程度的指标密切相关。但是，在非小细胞肺癌中，pRb与预后之间的关系及其临床意义尚无一致结果。近年来，又先后发现了Rb基因家族的新成员，包括p107，Rb2／p130。p107和Rb2／p130功能上与pRb非常接近，但不完全相同。R五2/p130在非小细胞肺癌中的作用，研究甚少，主要来自于意大利的Clau击。研究小组，他们用免疫组化法检测了235例肺癌标本的pRb，pl07，R五2/p130，结果发现，pRb，pl07，RbZ/pl30表达降低，31 .6%的病人存在R五2/130基因的表达缺失，并且与肺癌进展分期有关。他们进一步采用SSCP方法对14例病人进行了基因变异筛选，结果1 1/14例病人在R五2/130基因的21和/或22外显子出现插人或点突变。但是，在肺癌特别是在非小细胞肺癌中，Rb及其家族以及参与调节孙功能的有关基因，特别是p16一eyeli可cDK一Rb途径和P53一P21一eyeli可cDK一Rb途径有哪些环节存在异常，是否存在种族差异，这些基因的异常与病理和临床分期，术后生存期之间存在何种关系均未明确，进一步深人研究对认识非小细胞肺癌的发病机理，临床进展和疾病预后具有重要意义。本研究的目的是探讨孙和pl6在肺腺癌中的表达，R五2/130，卢3和解1在非小细胞肺癌中的表达，非小细胞肺癌中R五2/130异常与基因序列和基因表达异常的关系，为认识非小细胞肺癌发生与发展、预后因素、及以B五2/130为靶基因开展基因治疗提供科学依据。材料与方法 1.临床资料 全组病人共130例，肺癌标本取自胸外科行肺叶或肺切除术的病人，均经病理组织学检查确诊，并接受了手术治疗，术前均未接受过化疗或放疗。病理分期采用IC CU标准。全部病人随访时间3一123个月(平均41 .5个月)。 2.组织病理学检查与免疫组化检测 标本取自患者的肺癌组织和癌旁正常肺组织，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切成4林M切片，HE常规染色后，进行病理诊断分型。免疫组化检查时，将标本用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。92一98℃加热修复抗原。用0.3%的过氧化氢一甲醇液阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗涤后，室温下添加10%正常羊抗兔血清(DAKO公司)封闭。然后分别加1: 400稀释的A刀u一Rb兔单抗(phanmngenCA);l:400稀释的Anti一pl6兔多克隆抗体(户~加gen，CA);1:20以)稀释的Anti一pR五2/pl30兔多克隆抗体;l:500稀释的 Anti一户3兔抗体和1:·2·500稀释的Anii一夕1兔抗体，室温下孵育1小时后，加人羊抗兔抗体(DA-KO公司)，60分钟后，按照avidin一hiotin辣根过氧化物酶试剂盒说明进行免疫染色(ABC试剂盒Vector，Burlingame，CA)。过氧化物酶反应在0.0005%HZ仇/0 .02%DAB/10mM NaN，混合液中进行，以二氨基联苯胺为终末染色原，用苏木素行核染色。免疫组化阳性对照采用已知有pRb和pl6蛋白表达的宫颈粘膜切片作为阳性对照。 RbZ/130，户3和夕1的免疫组化阳性对照采用SAOSZ细胞，将其置于玻片上后用50%丙酮/甲醇于4℃固定5分钟，之后按以上步骤进行实验。用免疫前血清代替一抗制备每一组织切片的阴性对照，以PBS作空白对照。以阳性片显色强度进行染色时间控制，脱水透明，封片。阳性细胞百分率评分标准:阳性细胞小于20%?