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叶酸作为一碳单位转移的重要辅助因子，对植物的生长非常重要。当叶酸合成受到阻碍时可以导致严重的发育异常，包括胚胎死亡、幼苗死亡、晚花和植株败育等各种现象。拟南芥叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化叶酸合成的最后一步，存在3个定位不同细胞区域的同源序列——定位于质体的DFB、定位于线粒体的DFC和定位于胞质的DFD。任何一种FPGS的单突变体在正常土壤环境中生长时没有明显表型，但双突变体则呈现植物矮化或败育等现象，说明叶酰聚谷氨酸合成酶的功能存在冗余。在低氮条件下dfc突变体与野生型植株相比其主根明显变短且叶酸含量降低，并且两天时在dfc突变体中检测到DFB基因的表达量明显升高，故推测低氮胁迫下DFB基因可能对dfc突变体中DFC基因的缺失具有补偿作用。因此本论文通过在dfc突变体中过表达DFB，观察低氮条件时dfc背景下DFB过表达植株的根长表型、植物体内叶酸和氮代谢在转录水平上的扰动和叶酸含量的变化，来探讨FPGS同工酶的功能冗余对植物低氮胁迫反应的影响。 此外，叶酸是光呼吸过程中甘氨酸脱羧酶GDCT的重要辅酶因子，对低氮条件下生长的dfc突变体进行高浓度二氧化碳处理（即非光呼吸条件）时，其主根长度和叶酸的含量也得到恢复，说明叶酸可能通过影响光呼吸而参与拟南芥的低氮胁迫反应。因此本论文还试图通过采用构建GDCT的RNAi载体、转化拟南芥的方法，尝试在植物体内使GDCT的表达水平降低，以探讨由于叶酸与GDCT蛋白相互作用的变化导致了dfc突变体不能适应低氮胁迫的可能性。 目前本论文取得的主要成果如下: 1、Gateway过表达系统构建PH2GW7-DFB过表达载体，通过农杆菌侵染dfc突变体的拟南芥花朵，所得到的种子在含有潮霉素抗性的1/2MS平板上进行抗性筛选和基因鉴定，得到30株过表达植株; 2、将获得的过表达株系进行反转录RT-PCR分析，结果显示过表达株系体内的DFB表达量与dfc和野生型相比确实升高; 3、在9.4N培养基上生长3天时，过表达株系的主根长度达到WT根长的110％～160％，与dfc根长差异显著;在0.3N培养基上生长3天，DFB过表达株系的主根更接近WT的主根长度，均比dfc主根长，且与dfc长度差异极显著。由此可得知，无论在9.4N或是0.3N条件下，过表达株系的根长均得到不同程度的恢复，低氮条件下过表达DFB可以促进dfc主根伸长，弥补DFC缺失造成的根长变短。 4、在低氮条件下，dfc突变体中与叶酸代谢和氮代谢相关基因如10-甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、谷氨酰氨合成酶1.1和硝酸根转运蛋白2.1的转录水平在适应低氮胁迫中变化的模式与WT不同，而在dfc中过表达DFB基因后植物在适应低氮时的这些基因的相关扰动都恢复至更接近WT，说明DFB基因能一定程度上弥补DFC功能缺失对叶酸与氮代谢造成的扰动。 5、采用HPLC/MS/MS测定生长3天的过表达株系体内叶酸含量变化。在9.4N条件下，过表达株系的5-F-THF的含量达到WT的110％左右，与dfc相比其含量显著增加。而在0.3N条件下，过表达株系中5-F-THF的含量与WT相似，比dfc明显增加，其差异极显著。这说明在dfc中过表达DFB在一定程度上可以弥补DFC基因缺失造成的叶酸含量降低。 6、设计GDCT基因序列的同源序列，通过Gateway将同源序列分别正向和反向插入PK7WIWG2的两个不同位置，经过基因鉴定、酶切鉴定及测序等方法进行鉴定，最后成功构建GDCT的RNAi载体。 总体来说，本论文初步探讨了叶酰聚谷氨酸合成酶FPGS在适应低氮胁迫过程中的功能冗余，同时通过Gateway成功构建RNAi-GDCT载体，为能进一步探讨叶酸如何参与光呼吸打下基础。