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大豆蛋白是一种具有独特加工性能的营养保健蛋白,并作为重要的食品原料被广泛应用于素食与肉制品加工中。但大豆蛋白含有致敏原成分,如β-伴大豆球蛋白α亚基和α’亚基,给大豆过敏人群带来了严重的健康隐患。过敏反应可造成皮肤、呼吸道、胃肠道等不良反应,严重的话会导致休克甚至死亡。因此,寻求一种能有效降解大豆蛋白过敏原的方法变得至关重要。前期研究中,本实验室通过筛选获得了一株野生菌Bacillus sp.BBE201108,其产生的蛋白酶能够降解大豆蛋白主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基。为进一步分析该菌株所产蛋白酶的性质及功能,本研究分离纯化得到Bacillus sp.BBE201108蛋白酶,研究其酶学性质及其对大豆蛋白过敏原的降解效果;此后,将其与商品酶组合,考察复配酶对大豆蛋白过敏原的降解效果;最后对Bacillus sp.BBE201108蛋白酶进行固定化,分析固定化酶的酶学性质及其对大豆蛋白过敏原的降解效果。本论文主要内容如下:(1)分离纯化Bacillus sp.BBE201108所产蛋白酶。依次经过硫酸铵分级沉淀、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析,从Bacillus sp.BBE201108发酵液中纯化得到电泳纯的蛋白酶,比酶活由244.20 U?mg-1提高至2,575.45 U?mg-1,纯化倍数达10.55,酶活回收率为6.48%。对纯化得到的Bacillus sp.BBE201108蛋白酶进行酶学性质分析,推测该白酶属于丝氨酸蛋白酶;该酶的最适反应p H和温度分别为8.0和50?C。Mn2+、Fe2+、Cu2+、十二烷基硫酸钠、吐温80和二硫苏糖醇显著抑制该酶的酶活;该蛋白酶的Km为4.19 g?L-1,Vmax为4.04 g?L-1?s-1,kcat为107.73 s-1,kcat/Km为25.71 L?g-1?s-1。将Bacillus sp.BBE201108蛋白酶水解后大豆分离蛋白反应液进行SDS-PAGE验证,结果显示该酶能有效降解大豆蛋白过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基和α’亚基。(2)以大豆分离蛋白为底物,以水解度为考察指标,选择Bacillus sp.BBE201108蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶及其复配酶进行水解,对比各蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效果。通过对比发现Bacillus sp.BBE201108蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶以2:1:1的比例组合时复配效果最优;与单一酶相比,复配酶对大豆分离蛋白的水解度明显提高。(3)以海藻酸钠为载体,采用包埋法固定Bacillus sp.BBE201108蛋白酶,通过单因素实验确定的最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度30 g?L-1,Ca Cl2溶液浓度20 g?L-1,酶液与海藻酸钠溶液体积比为1:2,固定化时间为1 h。在此条件下,酶活回收率为63.42%。固定化Bacillus sp.BBE201108蛋白酶与游离Bacillus sp.BBE201108蛋白酶的酶学性质相比,固定化酶的最适作用温度升高了10?C,对温度和p H的适应范围均增宽,热稳定性显著提高。将固定化酶与大豆分离蛋白反应的水解液进行SDS-PAGE验证,结果显示固定化酶亦能有效降解大豆蛋白过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基和α’亚基。与游离酶相比,固定化酶对β-伴大豆球蛋白α亚基和α’亚基的特异性改善。