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前言 赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是曲霉属和青霉属的一些菌种产生的有毒代谢产物，是异香豆素联结L-苯丙氨酸在分子结构上类似的一组化合物，包括赭曲霉毒素A、B和C，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OA)因其污染广泛、毒性最大而受到重视。1993年，国际癌症研究中心已将OA列为可能的人类致癌物。有资料表明，OA与巴尔干地区的慢性肾病和泌尿系统肿瘤有关。动物毒性实验显示：OA具有免疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。 OA的检测方法有薄层液相色谱法(TLC)、荧光分光光度计法(Spectrofluorometry)、高压液相色谱法(HPLC)及酶联免疫吸附法(ELISA)等。1991年我国建立了OA的TLC标准检验方法。1992年，阳传和等建立了检测粮食中OA单抗ELISA方法。但尚未建立用HPLC测定OA的方法。 本研究旨在建立用HPLC检测小麦、水稻和培养液中OA的方法，并在此基础上对沈阳地区小麦、水稻中OA的污染情况进行检测，比较黑曲霉的不同菌株在不同培养液中的产毒能力。为评价我国粮食中OA的污染现状及发酵用真菌菌种的管理提供科学依据。 材料与方法 1．样品 水稻27份，小麦35份，均采自沈阳地区粮库；分别含uv-11、uv-48、3-350、3324、黑曲等五种黑曲霉霉菌的麦蛋、麦酵、土酵培养液样品，由卫生部食品卫生监督检测中心提供。 2．实验方法 2．互 色谱条件的确定 2．1．l 检测波长的确定 配制浓度为50ng／Inl的OA标准溶液。用荧光分光光度计检测其激发光谱和吸收光谱，确定最适激发光波长和发射光波长。 2．1．2 流动相的确定 检测不同流动相时浓度为500n矿IIl的OA标准溶液的色谱峰面积，确定最适的流动相。 2．1．3 分离柱柱温的确定 检测不同分离柱柱温时浓度为50n牙d的OA标准溶液的色谱峰面积，确定最适的分离柱柱温。 2．2 标准曲线的制作 配制浓度为分别Zng／rnl3 J j ＊IIl上00ng／rnl／00ngirnl300ng／all的系列标准溶液。40gi进样，制作标准曲线。 2．3 样品前处理 2．3．l 小麦、水稻样品的前处理 称取＊ 粉碎样品于150Inl具塞玻瓶中，加 60rnl氯仿3．lmoUL磷酸振荡革取30min，经定性滤纸快速过滤。取10Inl滤液转移至10Inl离心玻璃管中，60℃水浴上用氮气吹干。立刻加人400gi乙睛一一．008moVL磷酸阳6：44，V／V）溶液旋涡振荡 lmin，再加人 lrnl正己烷旋涡振荡lmin脱脂。4000rpm离心10min，取底层40tri加样。 2．3．2 培养液样品的前处理 量取ZInl样品于150rnl具塞三角烧瓶中。加0．smol／L H。PO。一ZmoUL NaCI混合液（PHI．6）10rnl，震荡 lmin。再加人 srnl氯仿，用恒温水浴振荡器振荡30min。2500 mp离心 15ndn后，吸取下层有机相。再用 srnl氯仿羊取无机相，离心后吸取下层有机相与第一次有机相合并混匀。取srnl有机相转移至10Inl离心玻璃管中，60℃水浴上用氮气吹干。立刻加人44gi乙睛一一一．48m。UL磷酸O6：44，V／V）溶液旋涡振荡 lmin，再加人 lrnl正己烷旋涡振荡 Indn。2500rmP离心 ·2·10而n，取底层 40gi 力样 2．4 方法精密度的检测 配制浓度分别为sngllnlj加g／Inlj00ng／ml的 OA标准溶液，每种浓度3个平行样。在相同条件下连续6d重复测定共计6次。分别计算各种浓度测定结果的相对标准偏差（R．S．D．人 2．5 方法回收率的检测 测定不同样品方法的回收率，加标量分别为 lug／kg3 ＂g／kg。50p矿kg，样品处理后进行色谱测定。 2．6 确证实验用形成OA甲酯的方法确证。分别定量转移样品溶液和标准溶液至试管中，蒸发至干。各加 0．srnl 14％三氟化硼一甲醇试剂，密塞，在50－·60℃水浴上加热15min，于蒸气浴上用氮气蒸发至干，如仍有水分，加 IInl乙晴后继续蒸发至干。加入 400pl乙睛一0·008moVL穆酸（56：44，V／V）溶液旋涡振荡 1dn，40…进样。如果是OA阳性的样品，则OA峰消失，而出现OA甲酉峰（与标准比较）。 2．7 数据处理 用 EXECELSPSS软件进行实验数据统计分析／检验。 实验结果 1。最适宜色谱条件 1．二 检测波长 通过荧光扫描，结合本研究的具体情况，测得检测OA的最适波长为：激发波长338urn，发射波长455urn。 1．2 流动相 分别用三种不同流动相测定OA标准（浓度55ng／Inl）的色谱峰面积，同等条件下乙睛一一．008moVL磷酸u6：44，V／V）作流动相时荧光强度最大。 1．3 温度 同等条件下月A的荧光强度受分离柱温度的影响不大。在本实验中，30℃时OA的荧光强度最高。 综上，确定的色谱条件为：流动相为乙睛一一．008moUL磷酸 ·3·o6：44，V／V人流速为二．0 Im／min；荧光检测器，激发波长 338urn，发射波长为455urn；柱温为30℃。 2．标准曲线 OA标准浓度在2－500ng／nd范围内，用OA标准的浓度（X）和色谱峰面积门）作图，制得标准曲线?