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正常生理情况下，机体器官和组织的pH值被精密调控在7.4左右。许多免疫相关的病理过程（如炎症、肿瘤等）的病灶组织局部会出现酸化，进而对疾病过程中免疫细胞的发展变化产生重要影响。 目的:酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）是H+门控的离子通道，属于上皮钠通道/退化蛋白（epithelialsodium channel/degenerin，ENaC/DEC）家族成员。ASICs是由4个基因（ASIC1、ASIC2及ASIC3及ASIC4）选择性剪接表达的产物，目前已发现其至少可编码6个不同亚基（ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3及ASIC4）。ASICs广泛分布于中枢及外周神经系统，亦表达于心肌、味蕾等非神经组织。近年报道，非神经细胞（骨细胞、平滑肌细胞）和T淋巴细胞等也可表达ASICs，并参与相关细胞的功能调控。 巨噬细胞是机体最重要的抗原提呈细胞之一，是机体清除病原微生物的重要工具。巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体，在体内外复杂的微环境中，巨噬细胞存在一系列连续功能状态，而M1型（经典活化型巨噬细胞，classically activated macrophage）和M2型（替代活化型巨噬细胞，alternatively activated macrophage）巨噬细胞是这种连续状态的两个极端。巨噬细胞极化过程中伴随有获取能量主要来源的代谢途径再编程现象。静息巨噬细胞主要利用糖酵解和氧化磷酸化；M1巨噬细胞则主要利用有氧糖酵解；激活的M2巨噬细胞依赖脂肪酸β-氧化（fatty acidβ-oxidation，FAO）提供ATP。除上述几种代谢类型之外，有研究表明，谷氨酰胺代谢在免疫细胞激活过程中也发挥重要作用。谷氨酰胺是机体氨基酸营养缺陷时调控免疫细胞功能的重要条件性非必需氨基酸。有研究证明M1巨噬细胞依赖谷氨酰胺代谢，其可以通过谷氨酰胺酶（GLS）将谷氨酰胺转化谷氨酸，再转化为α-酮戊二酸（α-KG），进而回补三羧酸循环（TCA）。 方法:本课题组前期工作显示，巨噬细胞表达ASIC1与ASIC3，并且其能介导细胞外微环境酸化引起的巨噬细胞功能变化，而具体的通道与机制不明。本课题组目前拟研究细胞外酸化对小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived macrophage，BMM）极化过程的影响，并探讨ASIC1a在其中所发挥的作用以及该作用与细胞代谢重编程的相关性，计划采用ASIC激动剂和抑制剂、siRNA、ASIC1a-/-小鼠等不同方法验证。本论文主要探讨了在正常pH环境中ASIC1a对于M1巨噬细胞极化过程的影响以及谷氨酰胺代谢在M1巨噬细胞极化代谢再编程中的作用，为以后进一步研究酸性微环境下M1巨噬细胞极化过程中的代谢再编程奠定基础。 结果:一、ASIC1a可能影响M1巨噬细胞极化 1．ASIC1a激动剂和抑制剂影响M1巨噬细胞极化过程 用ASICs广谱抑制剂阿米洛利（Amiloride，100μM）预处理30min，然后用ASIC1a特异性激动剂MitTx（20nM）和（或）阿米洛利处理细胞，同时加入LPS（100ng/ml）处理6h以诱导M1巨噬细胞。ELISA检测细胞培养上清中细胞因子水平。结果表明，ASIC1a特异性激动剂MitTx能够增加M1巨噬细胞极化过程中分泌的IL-6（24h）、TNF-α（6h），而这种增强效果能够完全被阿米洛利阻断。说明在LPS诱导的M1巨噬细胞极化过程中ASIC1a促进其细胞因子的产生。 2．ASIC1a siRNA下调ASIC1a蛋白表达，影响M1巨噬细胞极化 酸敏感离通道小干扰RNA（ASIC1asiRNA）转染BMM后，加入LPS（100ng/ml）处理6h以诱导M1巨噬细胞，ELISA检测结果表明，下调ASIC1a蛋白表达可减少LPS诱导的M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α水平。 3．ASIC1a表达缺失影响M1巨噬细胞极化过程 应用ASIC1a-/-小鼠，同时用野生型小鼠作对照，对比分析ASIC1a缺失对于M1巨噬细胞极化过程的影响。 （1）分别提取WT以及ASIC1a-/-小鼠骨髓以诱导BMM，加入LPS（100ng/ml）处理6h以诱导M1巨噬细胞，ELISA、WB、Real-time PCR检测细胞因子表达。结果表明，ASIC1a-/-小鼠M1巨噬细胞极化过程中产生的IL-6、TNF-α水平以及表达iNOS蛋白水平均无明显影响，亦不影响这些分子以及IL-1β的mRNA水平； （2）分别提取WT以及ASIC1a-/-小鼠骨髓以诱导BMM,加入LPS（100ng/ml）和IFN-γ（20ng/ml）处理48h以诱导M1巨噬细胞，细胞表面流式检测细胞表面膜分子表达水平发现，ASIC1a表达缺失能够升高细胞表面CD80、CD86的表达水平，而对于MHC II没有明显影响。 二、干预谷氨酰胺回补效应影响M1巨噬细胞极化 取野生型小鼠骨髓，用正常DMEM培养基（10%FBS,1%P/S，50ng/ml M-CSF）诱导骨髓来源巨噬细胞，用无谷氨酰胺培养基培养细胞，同时在此培养基中另外加入谷氨酰胺溶液（使其终浓度为4mM）作为对照，加入100ng/ml LPS处理细胞6h以诱导M1巨噬细胞。ELISA、WB、Real-time PCR检测细胞产生炎症反应相关分子结果表明，剥夺谷氨酰胺培养使得M1巨噬细胞极化过程中分泌的细胞因子IL-6、TNF-α水平增加，细胞表达iNOS蛋白水平增高，同时，细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平升高。上述结果提示谷氨酰胺剥夺能够协同M1巨噬细胞极化过程。 结论:1．激活ASIC1a促进M1巨噬细胞极化过程中IL-6、TNF-α的分泌。 2．使用ASIC1asiRNA干扰ASIC1蛋白表达之后,减少M1巨噬细胞极化过程中IL-6、TNF-α的分泌。 3．ASIC1a表达缺失对于巨噬细胞M1巨噬细胞极化过程中表达IL-6、TNF-α、iNOS无明显影响,但可以增强M1巨噬细胞表面膜分子CD80、CD86的表达，对于MHC II无明显影响。 4．培养基中剥夺谷氨酰胺能够增强巨噬细胞极化为M1巨噬细胞。