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转录因子Apontic（Apt）是一个bZIP蛋白，在果蝇胚胎的头、翅、心脏、气管、眼、神经系统等多种组织的发育过程中发挥关键性的作用。人的Apt同源蛋白Fibrinogen silencer-binding protein（FSBP）是一个癌症相关因子，能够影响人的肺、脑、心脏等多种组织的发育。在家蚕中，已知Bmapt能够通过调控表皮色素的合成来影响其在自然界中的色彩多样性，但Bmapt在其他组织中的功能研究还不清楚。 家蚕是鳞翅目昆虫的模式物种，它具有饮食结构单一，饲养周期较短，容易解剖，遗传资源丰富和研究历史悠久等特点；与果蝇相比，家蚕的结构比较简单，体型较大，容易进行实验操作。另外，随着家蚕基因组测序的完成，家蚕基因的功能研究将会取得更大的进展。因此，以家蚕为实验材料来研究基因的功能具有很大的发展前景。 本实验以家蚕为研究对象，分析了BmApt蛋白的结构和进化关系，利用免疫染色和RNA干涉等技术研究了其在家蚕神经、丝腺等组织的表达模式和与轴突导向因子Netrin、Frazzled的调控关系。主要结果如下： （1）BmApt的蛋白结构分析 以果蝇DmApt、家蚕BmApt和人HsFSBP蛋白序列为基础，使用DNASIS MAX Version 3.0软件进行序列比对，结果显示DmApt、BmApt和HsFSBP三者的Myc/SANT结构和碱性DNA结合结构域（basic DNA binding domain）的大部分序列是一致的，说明三者的这两个结构域是非常保守的。然而，对于亮氨酸拉链结构（Leucine zipper domain）与碱性DNA结合结构域之间的距离，家蚕BmApt要远于果蝇DmApt，这可能与碱性DNA结合结构域的结合能力有关。 （2）BmApt的进化分析 以NCBI数据库中家蚕BmApt及其它物种的同源蛋白序列为基础，使用MEGA5.05软件构建系统发育树，结果显示，家蚕BmApt蛋白序列与鳞翅目昆虫红珠凤蝶的在进化上更加接近，而与膜翅目、双翅目昆虫的遗传距离则稍远一些。 （3）BmApt抗体制备 根据NCBI数据库中查找到的家蚕Bmapt的CDS全长序列设计引物，通过PCR得到目的基因Bmapt。提取目的质粒构建重组表达载体pET28a-Bmapt，在BL21感受态细胞中原核表达得到目的融合蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白以包涵体形式存在于细胞中。将纯化后的融合蛋白免疫兔子后，提取血清纯化得到多克隆抗体，用ELISA 和Western blot对抗体效价进行检测，结果显示抗原和抗体能够产生特异性结合反应。 （4）BmApt的组织表达模式分析 利用免疫染色技术，分别对家蚕不同发育期的神经和丝腺，5龄3天的幼虫大脑、气管和脂肪体进行BmApt抗体染色。结果显示，在家蚕的神经系统中，BmApt能够在20、21、22期胚胎的中枢神经和幼虫大脑表达，这表明BmApt与家蚕的神经系统发育有关；在气管和脂肪体组织中，BmApt能够在其细胞核表达，这说明BmApt能够影响家蚕的气管和脂肪体发育；在不同龄期的丝腺组织中，BmApt与Cyclin E在丝腺细胞中共定位，这些结果说明BmApt可能通过调控cyclin E来影响家蚕丝腺的发育。 （5）Bmapt siRNA干涉分析 以siRNA诱导的RNAi技术来研究Bmapt基因的功能。设计并合成两条Bmapt siRNA片段，溶解后混合稀释成50μM体系注射到家蚕的早期胚胎中，以通用引物NC siRNA注射的胚胎作为对照。结果显示，Bmapt在注射Bmapt siRNA的家蚕胚胎的神经细胞的表达明显少于对照，并且胚胎两边的轴突离中线的距离比对照更宽一些。这些数据表明Bmapt可能对家蚕的轴突导向有一定的吸引作用。利用荧光定量实验进一步验证，结果发现BmnetrinA、BmnetrinB和Bmfrazzled的相对表达量都明显降低，由此说明Bmapt通过激活BmnetrinA、BmnetrinB和Bmfrazzled的表达来调控神经系统的发育。