Clostridium beijerinckii丁醇高产突变株选育及利用竹子发酵生产丁醇技术研究

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能源枯竭和环境污染的双重压力,促进了各国对生物燃料的研究和开发,生物丁醇以优于生物乙醇的诸多特点,成为各国研究的焦点。  本研究首先以Clostridium beijerinckii NCIMB8052为出发菌株,利用紫外诱变和高丁醇环境筛选的方法,最终获得一株耐丁醇高产突变株,命名为Clostridium beijerinckii ZL01。与出发菌株C.beijerinckii NCIMB8052相比,C.beijerinckii ZL01对丁醇初始浓度的耐受能力从10.00g/L提高到11.00g/L。5L发酵罐的分批发酵结果表明:丁醇的产量从10.34g/L增加到15.01g/L,提高45.16%;总溶剂从12.87g/L增加到19.55g/L,提高49.01%;发酵周期从48h缩短到44h,发酵强度从0.27g/(L·h)提高到0.44 g/(L·h)。遗传稳定性实验表明:该菌株连续传代20次,溶剂产量稳定,菌株无明显退化。  其次,以C.beijerinckii ZL01为实验菌株,研究竹子水解液中的发酵抑制物对菌体生长和发酵丁醇的影响。通过高效液相色谱确定了竹子水解液中12种主要的发酵抑制物,分别是甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、香草醛、香草酸、丁香醛、丁香酸、香豆酸和阿魏酸。单一抑制物实验结果证实上述物质能够抑制菌体的生长和溶剂的产生,它们对溶剂产生的抑制强度从高到低为:香草醛>丁香醛>4-羟基苯甲酸>丁香酸>4-羟基苯甲醛>香草酸>香豆酸>阿魏酸>甲酸>羟甲基糠醛>糠醛>乙酸。总体来讲,由木质素降解产生的小分子木质素单体对C.beijerinckii ZL01的毒性最强,其中,酚醛类物质对丁醇发酵的抑制作用明显强于其相应的酚酸类物质。香草醛的毒性最大,当培养基中存在0.20g/L的香草醛时,菌体仅能产生2.35g/L的丁醇和3.52g/L的总溶剂。有机酸(甲酸、乙酸)和呋喃类物质(糠醛、羟甲基糠醛)对C.beijerinckii ZL01菌体生长和丁醇发酵的抑制作用相对较弱。  进一步的组合抑制物实验表明,甲酸和乙酸之间、糠醛和羟甲基糠醛之间对C.beijerinckii ZL01发酵产丁醇具有协同抑制作用。菌体对有机酸(甲酸和乙酸)组合的耐受浓度为甲酸0.125g/L,乙酸2.50g/L;对呋喃类物质(糠醛和羟甲基糠醛)组合的耐受浓度为糠醛2.00g/L,羟甲基糠醛2.00g/L;木质素单体主要是通过短板效应来影响菌体发酵产丁醇,菌体对木质素单体4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸的耐受浓度均为0.20g/L,对4-羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛的耐受浓度均为0.10g/L,对木质素单体组合的耐受浓度为0.1g/L,每种木质素单体均为0.0125g/L。有机酸和呋喃类物质之间以及有机酸和木质素单体之间对C.beijerinckii ZL01基本没有协同抑制作用,而呋喃类物质与木质素单体之间以及三类物质之间对C.beijerinckii ZL01发酵产丁醇具有协同抑制作用。  最后针对C.beijerinckii ZL01不能直接利用竹子水解液发酵生产丁醇的问题,本研究利用2.0%的糖用活性碳对竹子水解液进行脱毒处理,发现对呋喃类物质和木质素单体的脱除率分别为64.25%和93.60%,糖损失为4.55.0%。C.beijerinckiiZL01能利用活性碳脱毒液发酵产丁醇,丁醇和总溶剂的产量分别为5.54g/L和8.01g/L。
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