杞精明目汤对结膜松弛症成纤维细胞表达TSg-6、PTX3及泪液渗透压影响的研究

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目的:研究结膜松弛症(CCh)肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)、穿透素-3(PTX3)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达及杞精明目汤药物血清对其调控作用;观察杞精明目汤对CCh患者泪液渗透压的影响。  方法:  1.CCh松弛结膜组织TSG-6和PTX3的表达及细胞凋亡检测:制备结膜组织冰冻切片,采用免疫荧光法检测TSG-6和PTX3的表达;Tunel法检测结膜组织细胞凋亡。  2.CCh成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3的表达及TNF-α/IL-1β对其调控作用:分别用含TNF-α或IL-1β的培养基和含相同浓度PBS的培养基培养结膜成纤维细胞,采用RT-PCR和Western Blot检测TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3的表达变化。  3.杞精明目汤药物血清对CCh成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3表达的影响:制备5%、10%、20%三种浓度的杞精明目汤药物血清,并用其干预结膜成纤维细胞,采用RT-PCR和Western blot检测TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3的表达变化。  4.观察CCh患者泪液渗透压水平及杞精明目汤对其影响作用:收集30例CCh患者,同时设干眼症和单纯白内障患者(各30例)为对照组,采用TearTMLab泪液渗透压计测量受试者泪液渗透压,并进行眼表疾病指数评分(OSDI)和泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色(fl)、基础泪液分泌(SchirmerⅠ test)检查,观察CCh泪液渗透压水平并分析CCh泪液渗透压与其临床症状体征之间的相关性;收集60例Ⅱ~Ⅲ级肝肾阴虚型CCh患者,随机分为杞精明目汤联合人工泪液治疗组和单纯人工泪液治疗对照组,疗程3个月,比较治疗前后CCh泪液渗透压及OSDI、BUT、fl、SⅠt的变化。  结果:  1.CCh结膜组织TSG-6、PTX3的表达及细胞凋亡:TSG-6在CCh结膜上皮层、结膜基质层及Tenons囊中均呈强阳性表达;在正常结膜上皮层呈弱阳性表达,而在正常结膜基质层和Tenons囊不表达;PTX3在CCh的结膜上皮层、结膜基质层及Tenons囊中呈阳性表达而在正常结膜上皮层、结膜基质层及Tenons囊中不表达;CCh结膜上皮细胞凋亡率与正常组比较,差异无统计学意义,CCh结膜基质层及Tenons囊细胞凋亡率明显高于正常组,差异有统计学意义。  2.TNF-α和IL-1β对结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3表达的影响:CCh和正常结膜成纤维细胞对照组、TNF-α刺激组、IL-1β刺激组TSG-6(mRNA: F=4126.083,蛋白:F=127.446)、PTX3(mRNA: F=2276.6120,蛋白:F=8196)和MMP-1(mRNA:F=557.246,蛋白:F=40.859)、MMP-3(mRNA: F=110.953,蛋白:F=170.196)表达总体均数比较均有统计学意义; CCh成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3 mRNA和蛋白的表达较正常对照组均明显上调,差异均有统计学意义;TNF-α和IL-1β可明显上调CCh和正常结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3 mRNA及蛋白的表达,差异均有统计学意义。  3.杞精明目汤药物血清对CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3表达的影响:20%和10%的杞精明目汤药物血清能有效上调TSG-6的表达,差异无统计学意义,5%的含药血清对TSG-6的表达无明显作用;三种浓度的含药血清对PTX3的表达均无明显影响;三种浓度的含药血清均能有效抑制MMP-1、MMP-3的表达,20%和10%的含药血清对MMP-1的抑制作用差异不明显,优于5%的含药血清;20%的含药血清对MMP-3的抑制作用最明显,其次为10%。  4.CCh患者和干眼、单纯白内障患者泪液渗透压的比较分析:CCh组泪液渗透压(306.80±21.32 mOsms/L)较单纯白内障对照组(295.10±17.22 mOsms/L)明显升高;与干眼组泪液渗透压(312.77±20.67 mOsms/L)无显著差异;CCh组存在眼表症状体征的异常,其中OSDI(24.55±11.65)和角膜荧光素染色(1/4)较正常组OSDI(7.30±4.56)、角膜荧光素染色升高(0),但低于干眼组OSDI(30.33±9.29)、角膜荧光素染色(3/4),差异均有统计学意义;BUT(6.17±2.61s)较正常对照组(12.5±2.89s)缩短,较干眼组(4.77±2.29s)延长,差异均有统计学意义;SⅠt(6.13±3.19mm/5min)较正常对照组(15.00±4.17mm/5min)减少,但较干眼组(4.50±2.40mm/5min)增多,差异均有统计学意义。  5.CCh泪液渗透压与其临床特征之间的相关性分析:CCh泪液渗透压与性别(r=-0.056,P=0.769)、年龄(r=0.164,P=0.387)、角膜荧光素染色(r=0.295,P=0.114)、SⅠ t(r=-0.179,P=0.344)无明显相关;CCh泪液渗透压与分级呈正相关;CCh泪液渗透压与OSDI(r=0.601,P<0.001)呈正相关;CCh泪液渗透压与BUT(r=-0.603,P=0.001)呈负相关。  6.杞精明目汤对Ⅱ~Ⅲ级肝肾阴虚型CCh患者泪液渗透压的影响:杞精明目汤联合人工泪液治疗及单纯人工泪液治疗两种方法对CCh泪液渗透压均无明显影响,差异无统计学意义(t=-0.381,P=0.705);杞精明目汤联合人工泪液治疗对眼表症状的改善优于单纯人工泪液治疗法(t=-4.7,P<0.001);两种治疗方法均可延长泪膜破裂时间(t=-2.308,P=0.025)、减轻CCh患者角膜荧光素染色(Z=-2.257,P=0.024),但联合治疗法疗效优于单纯人工泪液治疗;联合治疗对CCh的基础泪液分泌有增加作用(t=2.088,P=0.046),而单纯人工泪液治疗法对CCh的SⅠt影响不大。  结论:  1.CCh结膜组织TSG-6和PTX3表达增加;CCh结膜基质层及Tenons囊细胞凋亡增多。  2.CCh成纤维细胞表达TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3明显上调;TNF-α和IL-1β均可上调CCh和正常结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3的表达;炎性因子参与CCh的发病机制。  3.20%和10%的杞精明目汤药物血清可上调TSG-6的表达;三种浓度的杞精明目汤药物血清对PTX3无显著作用;不同浓度的杞精明目汤药物血清均可有效抑制CCh成纤维细胞表达MMP-1和MMP-3。  4.CCh泪液渗透压较单纯白内障对照组升高,与干眼症组差异无统计学意义;CCh泪液渗透压与其分级、症状呈正相关,与BUT呈负相关,与性别、年龄、角膜荧光素染色及SⅠt无明显相关。  5.杞精明目汤联合人工泪液治疗对CCh泪液渗透压的影响不明显,但能有效改善CCh的眼表症状,延长泪膜破裂时间、改善角膜荧光素染色,并能增加基础泪液分泌。
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