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C肽作为连接肽(connecting peptide),含有31个氨基酸残基,在胰岛素的生物合成中起重要功能.最近的研究证实C肽可与细胞特异结合并具有细胞和生理活性,改变了以往对胰岛素原C肽是一种惰性肽的观点,从而提出,对l型糖尿病患者,C肽和胰岛素共同给药,进行替代治疗可能更接近于自然的形式,从而对患者更有利.为得到C肽的全长基因,我们首先合成两条部分互补的ssDNA,经退火、延伸后,以两条短的引物作PCR得到C肽的基因.利用设计的Sfi Ⅰ的酶切位点,酶切后产生非回文的粘性末端以保证C肽基因首尾相连,获得了胰岛素原C肽基因的三聚体.将其转入表达质粒pET-32a,在大肠杆菌BL21(DE3)中以融合蛋白的形式在上清中获得高效表达,表达量约为80mg/L.以兔抗人C肽的抗血清为一抗(1:100)进行的融合蛋白的Western-blot分析结果为阳性.该研究首次报道了C肽在水溶液中的化学稳定性.C肽的降解受pH及温度的影响很大,不同pH下的降解产物的RP-HPLC分析显示,在酸性和碱性的缓冲液中,C肽存在不同降解途径.pH3时,C肽的降解符合一级动力学反应,降解的速率受温度影响,70℃下的降解速率明显高于37℃时的降解速率.但在pH9的缓冲液中,C肽立即降解,且降解产物不随温度及时间变化.C肽在pH7缓冲液中最稳定,37℃或70℃下保温10h,分别有4.8％和10.8％的C肽降解.而同时加入1％BSA则显示较强的保护作用,37℃下保温10h,仅观察到1％的C肽降解.研究了C肽的细胞活性,首先研究了C肽对2型糖尿病人离体红细胞内Ca<2+>浓度及红细胞膜Na<+>K<+>-ATP酶活性的影响,结果表明外源C肽的加入可降低红细胞内的Ca<2+>浓度,升高红细胞的Na<+>K<+>-ATP酶的活性.C肽对所选细胞株神经胶质瘤细胞株U251、人肾细胞株cos-7和非洲绿猴肾细胞株293增殖的影响,结果表明,C肽对所选细胞株的增殖作用不明显.此外,根据实验需要,还用Rt-PCR的方法克隆了大鼠pCPB(procarboxypeptidase B)的cDNA序列,并在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达,表达产物pCPB经复性、胰蛋白酶酶切激活为活性CPB(carboxypeptidase B)后,用阴离子交换柱层析DEAE-FF和疏水柱层析进一步分离纯化得到活性CPB,每升发酵液可得40mg比活为7.42u/mg的活性CPB.该重组的CPB可替代提取的CPB应用于胰岛素原C肽的制备工艺中.