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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是多发于中老年期最常见的中枢神经系统退行性疾病,是造成老年性痴呆的主要原因。AD的发病原因和致病机制尚未完全明确,其主要的病理学特征包括弥漫性大脑萎缩、细胞外β-淀粉样蛋白(β—amyloid peptide,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SP)和细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)的出现,影响的脑区主要为皮层和海马区,其中Aβ的毒性作用扮演着重要的角色。患者主要的临床症状为缓慢进行性的记忆障碍和认知功能减退。其发病机制至今未明。
Tyro3属于受体型酪氨酸激酶家族中的TAM亚家族,于1991年被发现并被克隆。其在中枢神经系统内有区域特异性表达,高表达于脑内的皮层和海马的CA1、CA3区,主要分布在神经元,与神经元的发育密切相关。Tyro3单基因敲除鼠的皮层内有大量的神经元丢失,此外,出现海马长时程增强效应(long-termpotentiation,LTP)衰减,老龄鼠表现出痴呆症状。但迄今为止,尚未见Tyro3的表达与AD神经元变性的相关性研究报道,其在AD中的作用也尚未明了。
在本研究中,为明确Tyro3是否参与AD发病?我们利用Morris水迷宫检测不同月龄的AD动物模型APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力,并且检测脑内Aβ产生以及Tyro3表达的变化。在体外实验中,以Aβ1-42寡聚体为工具药作用于原代培养的海马神经元24 h,建立AD细胞损伤模型,观察Tyro3受体与突触蛋白的表达变化。为明确Tyro3参与AD发病是否与其影响APP代谢有关?我们建立了稳定表达APP突变体的HEK293细胞系,该细胞系能够产生并分泌大量的Aβ,向其转染Tyro3质粒,观察Tyro3过表达对Aβ产生的影响。
结果：
1.APP/PS1转基因小鼠在8月龄时出现空间学习记忆能力的下降,Aβ的产量随月龄增加而增加,10月龄转基因鼠的海马开始出现Tyro3表达量的上调。
2.培养原代海马神经元,用Aβ1-42寡聚体(终浓度10μM)作为工具药损伤神经元,作用24小时,分别用突触前蛋白synaptophysin、突触后蛋白PSD95和Tyro3受体蛋白的特异性抗体进行免疫荧光染色,并用激光共聚焦显微镜进行观察,结果显示,上述蛋白的特异性荧光强度在Aβ1-42寡聚体作用下都降低。
3.向稳定表达APP突变体的HEK293细胞瞬时转染CMV—Tyro3-CFP质粒表达载体,同时转染CMV—GFP表达载体作为对照,并同时加入Gas6(终浓度为100ng/ml),孵育24 h后,用激光共聚焦显微镜观察Tyro3-CFP和GFP的转染效率；取细胞上清用ELISA的方法检测Aβ产量。结果显示,与对照组相比,Tyro3过表达显著降低了Aβ的产量。同时,Tyro3过表达能够下调BACE1的蛋白表达水平。此效应受到其配体Gas6的抑制,并且这种抑制效应具有浓度依赖性。
结论：
本研究初步探讨了Tyro3受体在神经退行性疾病AD动物模型和细胞模型中的表达和作用。Tyro3受体的表达水平与APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆功能的改变及Aβ的产量增多及沉积有关。Tyro3受体的过表达能够降低HEK293APP细胞Aβ的产生。其原因可能是过表达Tyro3受体能够降低APP水解过程的限速酶BACE1的表达,且该效应不依赖于Tyro3的配体Gas6的作用。这些现象提示Tyro3受体可能参与了AD发病的过程,由此很可能成为预防或者治疗AD的一个新的靶点。