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研究背景肝纤维化是多种因素作用于肝脏引起的损伤修复反应,是慢性肝病发展为肝硬化甚至肝癌的共同途径。其中肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化发生发展的中心环节。当HSC活化后,产生α-平滑肌激动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA),并引起细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积。自噬是降解细胞内受损老化的细胞器及折叠错误大分子蛋白的一种代谢过程,其可通过降解脂滴为HSC活化提供能量,从而促进肝纤维化的发生发展。许多自噬相关分子参与自噬过程,其中微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)是自噬体膜上的标记蛋白,p62是自噬的降解底物。自噬相关蛋白9a(autophagy related protein 9a,Atg9a)参与自噬体膜的形成,在自噬起始过程中发挥重要作用。非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)可调控多种疾病的病理生理过程,近些年来受到越来越多的关注。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长度约为22 nt的短链非编码RNA,可通过与靶基因的3’端非翻译区(3’-untranslated regions,3’UTR)结合从而抑制或降解靶基因。miR-29家族分为miR-29a、miR-29b、miR-29c三种亚型。研究发现,在CC14诱导的纤维化肝组织中,miR-29家族下调,其中miR-29b亚型下调最为显著,且miR-29b在分离的原代HSC中表达较在其余肝脏细胞组分中高100多倍。因此,本研究将目标锁定miR-29b。同时,生物信息学分析发现,在小鼠和人中,miR-29b与Atg9a的3’UTR有结合位点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种长度大于200 nt的ncRNA,可调控miRNA进而调控靶基因的表达。长链非编码RNA核富集转录体1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)可促进 HSC 活化从而促进肝纤维化的发生发展。生物信息学分析发现,在小鼠和人中,NEAT1与miR-29b有结合位点。既然NEAT1与miR-29b有结合位点,miR-29b与Atg9a有结合位点,Atg9a参与自噬,因此推测NEAT1、miR-29b和Atg9a可能形成NEATl/miR-29b/Atg9a通路从而调控自噬。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein 1,IGFBPrP1)是导师课题组十余年来在国家自然科学基金资助下发现的新的致肝纤维化因子;随后继续研究发现其与目前公认致肝纤维化最强的细胞因子转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGFβ1)可相互调控,共同促进肝纤维化的发生发展;接着的研究又发现,IGFBPrP1可促进HSC自噬与活化,从而参与肝纤维化发生发展。不同学者分别研究发现,在体外培养的HSC中给予TGFβ1,可上调NEAT1表达,或下调miR-29b表达,或伴随Atg9a表达上调。研究证据如下:①TGFβ1干预小鼠原代HSC后,可下调miR-122表达,从而引起NEAT1表达上调;②TGFβ1使体外培养的人肝星状细胞株LX-2活化及ECM增多中,伴随miR-29b表达减少,过表达miR-29b后,可抑制TGFβ1诱导的LX-2活化及ECM表达;③TGFβ1诱导体外小鼠原代HSC活化过程中,伴随Atg9a表达上调。表明TGFβ1致肝纤维化的部分机制是其可调控HSC中NEAT1、miR-29b或Atg9a的表达。既然IGFBPrP1与TGFβ1可相互调控,共同促进肝纤维化的发生发展。那么,IGFBPrP1致肝纤维化形成中是否也像与TGFβ1一样,亦可调控HSC中NEAT1、miR-29b或Atg9a的表达呢?目前尚不清楚。在小鼠和人中,NEAT1与miR-29b有结合位点,miR-29b与Atg9a有结合位点,Atg9a为自噬发生所必需。导师课题组前期研究已发现IGFBPrP1可促进HSC自噬,从而致肝纤维化形成。那么,在IGFBPrP1致肝纤维化形成中,NEAT1、miR-29b、Atg9a及HSC自噬相互关系及作用地位如何?目前国内外尚未见相关文献报道。为此,本文以NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬为切入点进行研究。实验分为四部分,第一部分通过构建腺病毒介导IGFBPrP1致小鼠肝纤维化在体动物模型(导师课题组前期已成功建模),以明确IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中,肝组织中是否有NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬改变;第二部分以肝纤维化形成的中心环节肝星状细胞为研究对象,判定上调或下调IGFBPrP1对小鼠肝星状细胞株JS1中NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响并明确其意义;第三部分通过基因过表达或沉默技术,探索分别改变NEAT1、miR-29b或Atg9a的含量对IGFBPrP1过表达的JS1中自噬及活化、ECM表达的影响;第四部分通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等,探索NEAT1、miR-29b和Atg9a在IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中的关系。以期阐明IGFBPrP1致肝纤维化形成的部分机制,为肝纤维化的诊治提供新思路和新靶点。第一部分 lncRNANEAT1、miR-29b、Atg9a 和自噬在IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中的表达变化及意义实验一 IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中lncRNANEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬的动态变化及意义目的:判定IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中,是否有NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬改变,并明确其意义。方法:C57BL/6野生型雄性小鼠120只随机分为三组:AdIGFBPrP1组(n=40):小鼠尾静脉注射 0.1 mL 腺病毒介导的 IGFBPrP1(adnovirus-mediated IGFBPrP1,AdIGFBPrP1)2×109pfu/只;空病毒对照(Control adnovirus,CAd)组(n=40):小鼠尾静脉注射0.1 mL对照组空病毒2×109pfu/只;Control组(n=40):小鼠尾静脉注射 0.1 mL 生理盐水;各组分别于 1w(n=8)、2w(n=8)、4w(n=8)、8w(n=8)、12 w(n=8)末留取肝组织待测。HE染色及Sirius red染色观察肝组织病理学改变和胶原纤维分布及含量;qRT-PCR检测肝组织中IGFBPrP1、α-SMA、NEAT1、miR-29b、Atg9a、LC3B RNA 的表达;Western blot 检测肝组织中 IGFBPrP1、α-SMA、Ⅰ 型胶原纤维(collagen type Ⅰ,collagen Ⅰ)、Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62 蛋白表达。结果:(1)qRT-PCR及Western blot检测AdIGFBPrP1转染后,小鼠肝组织中IGFBPrP1表达变化:IGFBPrP1 mRNA及蛋白于AdIGFBPrP1 1 w组表达升高且达高峰,于2 w、4 w、8 w、12 w组随时间推移表达逐渐降低,但仍高于Control组(P<0.05)。(2)小鼠肝组织病理学改变:HE染色和Sirius red染色结果显示,小鼠肝组织过表达IGFBPrP1后出现肝细胞变性、坏死,炎细胞浸润,胆管增生,胶原纤维增生,提示小鼠肝纤维化形成。(3)qRT-PCR 及 Western blot 检测小鼠肝组织过表达 IGFBPrP1 后 α-SMA、collagen Ⅰ表达变化:α-SMA mRNA及蛋白,collagen Ⅰ蛋白于1 w组表达升高且随时间推移逐渐升高(P<0.05)。这说明过表达IGFBPrP1后,小鼠肝组织HSC活化,ECM表达增多,进一步提示小鼠肝纤维化形成。(4)qRT-PCR检测小鼠肝组织过表达IGFBPrP1后NEAT1、miR-29b RNA的表达变化:NEAT1 RNA于AdIGFBPrP1 1 w组表达升高且达高峰,随后于2w、4w、8w、12 w组随着时间增加逐渐减少,但仍高于Control组(P<0.05);miR-29b RNA表达趋势与NEAT1 RNA相反,于1 w组表达降低且达最低点,随后2 w、4 w、8 w、12 w组随着时间增加逐渐增多,但仍低于Control组(P<0.05)。(5)qRT-PCR及Western blot检测小鼠肝组织过表达IGFBPrP1后Atg9a的表达变化:Atg9a mRNA及蛋白于AdIGFBPrP1 1 w组表达升高且达高峰,于2 w、4 w、8 w、12 w组表达随着时间推移逐渐下降,但仍高于Control组(P<0.05)。(6)qRT-PCR 及 Western blot 检测小鼠肝组织过表达 IGFBPrP1 后 LC3B、SQSTM1/p62的表达变化:LC3B mRNA及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白于AdIGFBPrP1 1 w组表达升高且达高峰,于2 w、4 w、8 w、12 w组表达随着时间推移逐渐下降,但仍高于Control组(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白与LC3B趋势相反(P<0.05)。结论:IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中,肝组织中NEAT1、Atg9a和自噬表达增加,miR-29b表达减少,HSC活化、ECM表达增多。提示IGFBPrP1可作为上游因素上调小鼠肝组织中NEAT1、Atg9a和自噬的表达、下调miR-29b的表达,促进HSC活化及ECM增多从而导致小鼠肝纤维化形成。第二部分上调或下调IGFBPrP1对小鼠肝星状细胞株JS1中lncRNANEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响及意义实验二上调 IGFBPrP1 对 JS1 中 lncRNA NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响及意义目的:判定上调IGFBPrP1对JS1中NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响,并明确其意义。方法:以小鼠肝星状细胞株JS1为研究对象,将不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)(10,50,100,200)的AdIGFBPrP1转染JS1,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光细胞的数量,筛选出最适MOI,并用于后续实验。然后,AdIGFBPrP1转染JS1,分三组:Control组:正常培养;CAd组:对照空病毒转染JS1细胞;AdIGFBPrP1组:腺病毒介导IGFBPrP1基因转染JS1细胞。各组分别于6h、12 h、24h、48h、72h 收集细胞,qRT-PCR 方法检测 IGFBPrP1、α-SMA、NEAT1、miR-29b、Atg9a、LC3B RNA 表达;Western blot检测IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ、Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62蛋白表达。结果:(1)AdIGFBPrP1转染JS1细胞最适MOI测定:MOI 200组细胞死亡率高于85%,MOI 100组转染效率高于MOI 10、MOI 50组(P<0.05),故MOI 100为最适MOI,用于后续实验。(2)qRT-PCR 和 Western blot检测 AdIGFBPrP1 转染 JS1 后 IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ表达变化:IGFBPrP1 mRNA及蛋白于AdIGFBPrP1 6 h组表达升高,且随着时间增加表达逐渐升高,于48 h组达高峰,72 h组表达较48 h组有所下降,但仍高于Control组(P<0.05);α-SMA mRNA及蛋白于6 h组开始升高并随时间推移逐渐升高,collagen Ⅰ蛋白表达于12 h组开始升高并随时间推移逐渐升高(P<0.05)。(3)qRT-PCR检测 JS1细胞过表达IGFBPrP1后NEAT1、miR-29b RNA的表达变化:NEAT1 RNA于AdIGFBPrP1 6 h组升高且随时间推移逐渐升高,于48 h组达高峰,72 h 组有所下降,但仍高于 Control 组(P<0.05);miR-29b RNA 于 AdIGFBPrP1 6 h组下降且随时间推移逐渐降低,于48 h组达最低点,72 h组有所回升,但仍低于Control组(P<0.05)。(4)qRT-PCR和Western blot检测JS1细胞过表达IGFBPrP1后Atg9a的表达变化:Atg9a mRNA及蛋白于AdIGFBPrP1 6 h组升高且随时间推移逐渐升高,于48 h达峰值,72 h有所下降,但仍高于Control组(P<0.05)。(5)qRT-PCR 和 Western blot检测 JS1 细胞过表达 IGFBPrP1 后 LC3B、SQSTM1/p62的表达变化:LC3B mRNA及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白于AdIGFBPrP1 6 h组升高且随时间推移逐渐升高,于48 h达峰值,72 h有所下降,但仍高于Control组(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白与LC3B趋势相反(P<0.05)。结论:在体外培养的JS1中,上调IGFBPrP1后,首先NEAT1、Atg9a和自噬表达增加,miR-29b表达减少,JS1活化增加,而后ECM表达随之增多。提示IGFBPrP1可作为上游因素上调小鼠HSC中NEAT1、Atg9a和自噬表达、下调miR-29b的表达,促进小鼠HSC活化,进而ECM表达增多。实验三下调 IGFBPrP1 对 JS1 中 lncRNA NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响及意义目的:判定下调IGFBPrP1对JS1中NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达的影响,并明确其意义。方法:通过qRT-PCR从三条siIGFBPrP1中筛选沉默效率最高的一条,用于后续实验。然后siIGFBPrP1转染JS1,分四组:Control组:正常培养细胞48 h;Earle’s平衡盐溶液(earle’s balanced salt solution,EBSS)组:正常培养细胞44 h,收集细胞前用EBSS培养细胞4h;EBSS+对照siRNA(control siRNA,siRNA-NC)组:siRNA-NC转染细胞6 h后,换用正常培养基继续培养38 h,收集细胞前换用EBSS继续培养4 h;EBSS+siIGFBPrP1组:siIGFBPrP1转染细胞6 h后,换用正常培养液继续培养38 h,收集细胞前换用EBSS继续培养4h。qRT-PCR方法检测IGFBPrP1、α-SMA、NEAT1、miR-29b、Atg9a、LC3B RNA 表达;Western blot 检测 IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ、Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62 蛋白表达。结果:(1)siIGFBPrP1 沉默效率筛选:siIGFPBrP1-953 沉默效率高于 siIGFBPrP1-857、siIGFBPrP1-647(P<0.05),故选择 siIGFBPrP1-953 用于后续实验。(2)qRT-PCR 及 Western blot 检测 siIGFBPrP1 转染 JS1 后 IGFBPrP1、α-SMA、collagenI表达变化:与Control组相比,EBSS组中α-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达增加(P<0.05);表明EBSS可促进JS1活化及ECM表达增多;EBSS+siIGFBPrP1组IGFBPrP1 mRNA及蛋白表达明显低于EBSS组(P<0.05);EBSS+siIGFBPrP1组α-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达较EBSS组下降(P<0.05)。(3)qRT-PCR检测 siIGFBPrP1 转染 JS1 后 NEAT1 和 miR-29b RNA 表达变化:EBSS+siIGFBPrP1 组 NEAT1 RNA 表达低于 EBSS 组(P<0.05);EBSS+siIGFBPrP1组 miR-29b RNA 表达高于 EBSS 组(P<0.05)。(4)qRT-PCR 及 Western blot 检测 siIGFBPrP1 转染 JS1 后 Atg9a 的表达变化:EBSS+siIGFBPrP1 组 Atg9a mRNA 及蛋白表达低于 EBSS 组(P<0.05)。(5)qRT-PCR 及 Western blot检测 siIGFBPrP1 转染 JS1 后 LC3B、SQSTM1/p62 的表达变化:与Control组相比,EBSS组中LC3B mRNA及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达增加,SQSTM1/p62蛋白表达降低(P<0.05),表明EBSS可以促进JS1自噬;EBSS+siIGFBPrP1 组 LC3B mRNA 及 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 蛋白表达低于 EBSS 组(P<0.05),SQSTM1/p62 蛋白表达则高于 EBSS 组(P<0.05)。结论:在体外培养的JS1中,EBSS诱导基础上,下调IGFBPrP1后,JS1中NEAT1、Atg9a和自噬表达减少,miR-29b表达增加,JS1活化及ECM表达减少。提示IGFBPrP1可作为上游因素调控小鼠HSC中NEAT1、miR-29b、Atg9a和自噬表达,从而影响小鼠肝纤维化的形成。第三部分分别改变lncRNA NEAT1、miR-29b或Atg9a含量对IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达的影响及意义实验四上调或下调lncRNA NEAT1对IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达的影响及意义目的:探索上调或下调NEAT1是否影响IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达,并明确其意义。方法:首先通过qRT-PCR方法筛选沉默效果最好的一条siNEAT1用于后续实验。然后实验分组如下:Control组:正常培养JS1细胞48 h;AdIGFBPrP1组:AdIGFBPrP1转染JS1细胞48 h;AdIGFBPrP1+vector-NC组:对照空质粒转染JS1细胞6 h后,换用含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h;AdIGFBPrP1+NEAT1组:NEAT1过表达质粒按4 μg/孔转染JS1细胞6 h后,换用含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h;AdIGFBPrP1+siRNA-NC:对照siRNA转染细胞6 h后,换用含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h;AdIGFBPrP1+siNEAT1:siNEAT1按50 nM转染细胞6h后,换用含 AdIGFBPrP1 的培养液继续培养 42 h。qRT-PCR检测 NEAT1、LC3B、α-SMARNA表达;Western blot检测 LC3B、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen Ⅰ 蛋白表达。结果:(1)siNEAT1沉默效率筛选:siNEAT1-1654组NEAT1 RNA表达明显低于siNEAT1-183 和 siNEAT1-2644 组(P<0.05),故选择 siNEAT1-1654 用于后续实验。(2)qRT-PCR检测 NEAT1 过表达质粒或 siNEAT1 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中 NEAT1 RNA表达的影响:AdIGFBPrP1与NEAT1共转染组NEAT1 RNA表达明显高于AdIGFBPrP1 组(P<0.05),AdIGFBPrP1 与 siNEAT1 共转染组 NEAT1 RNA 表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(3)qRT-PCR及 Western blot检测上调或下调NEAT1 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中 LC3B、SQSTM1/p62表达的影响:NEAT1过表达质粒与AdIGFBPrP1共同转染组LC3B mRNA及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达明显高于AdIGFBPrP1组(P<0.05),而SQSTM1/p62 蛋白表达则低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05);siNEAT1 与 AdIGFBPrP1共同转染组LC3B mRNA及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达明显低于AdIGFBPrP1组(P<0.05),而 SQSTM1/p62 蛋白表达则高于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(4)qRT-PCR 及 Western blot 检测上调或下调 NEAT1 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中α-SMA、collagen Ⅰ表达的影响:NEAT1过表达质粒与AdIGFBPrP1共同转染组a-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达明显高于AdIGFBPrP1组(P<0.05)。siNEAT1与AdIGFBPrP1共同转染组α-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达明显低于AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。结论:在体外培养的JS1中,上调NEAT1增加IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达;下调NEAT1减少IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达。提示IGFBPrP1可通过正向调控NEAT1影响小鼠HSC自噬,进而影响小鼠HSC活化及ECM表达。实验五上调或下调miR-29b对IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达的影响及意义目的:探索上调或下调miR-29b是否影响IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达,并明确其意义。方法:实验分组如下:Control组:正常培养JS1细胞48 h;AdIGFBPrP1组:AdIGFBPrP1转染 JS1 细胞 48 h;AdIGFBPrP1+mimics-NC 组:对照 mimics 转染 JS1 细胞 6 h 后,换含 AdIGFBPrP1 的培养液继续培养 42 h;AdIGFBPrP1+miR-29b mimics 组:miR-29b mimics按50 nM转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h;AdIGFBPrP1+inhibitors-NC 组:对照 inhibitors 转染 JS1 细胞 6 h 后,换含 AdIGFBPrP1的培养液继续培养 42 h;AdIGFBPrP1+miR-29b inhibitors 组:miR-29b inhibitors 按 100 nM转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h。qRT-PCR检测miR-29b、LC3B、α-SMARNA 表达;Western blot 检测 LC3B、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达。结果:(1)qRT-PCR 检测gmiR-29b mimics 或 inhibitors 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中miR-29b RNA 表达的影响:AdIGFBPrP1 与 miR-29b mimics 共转染组 miR-29b RNA表达明显高于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05);AdIGFBPrP1 与 miR-29b inhibitors 共转染组 miR-29b RNA 表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(2)qRT-PCR 及 Western blot 检测上调或下调 miR-29b 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中LC3B、SQSTM1/p62 表达的影响:miR-29b mimics 与 AdIGFBPrP1 共同转染组 LC3B mRNA 及 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 蛋白表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05),而 SQSTM1/p62蛋白表达高于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05);miR-29b inhibitors 与 AdIGFBPrP1 共同转染组 LC3B mRNA 及 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 蛋白表达高于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05),而SQSTM1/p62 蛋白表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(3)qRT-PCR 及 Western blot 检测上调或下调 miR-29b 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达的影响:miR-29b mimics与AdIGFBPrP1共同转染组α-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达明显低于AdIGFBPrP1组(P<0.05);miR-29b inhibitors 与 AdIGFBPrP1 共同转染组 α-SMA mRNA 及蛋白、collagen Ⅰ 蛋白表达明显高于AdIGFBPrP1组(P<0.05)。结论:体外培养的JS1中,上调miR-29b减少IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达;下调miR-29b增加IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达。提示IGFBPrP1可通过负向调控miR-29b影响小鼠HSC自噬,进而影响小鼠HSC活化及ECM表达。实验六下调Atg9a对IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达的影响及意义目的:探索下调Atg9a是否影响IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达,并明确其意义。方法:首先筛选沉默效率最高的一条siAtg9a用于后续实验。后续实验分组如下:Control 组:正常培养 JS1 细胞 48 h;AdIGFBPrP1 组:AdIGFBPrP1 转染 JS1 细胞 48 h;AdIGFBPrP1+siRNA-NC 组:对照 siRNA 转染 JS1 细胞 6h 后,换含 AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h;AdIGFBPrP1+siAtg9a组:siAtg9a按50 nM转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养42 h。qRT-PCR检测 Atg9a、LC3B、α-SMA mRNA 表达;Western blot 检测 Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen Ⅰ 蛋白表达。结果:(1)siAtg9a沉默效率筛选:siAtg9a-1078组Atg9a mRNA表达明显低于siAtg9a-702 和 siAtg9a-1404 组(P<0.05)。故选择 siAtg9a-1078 用于后续实验。(2)qRT-PCR 及 Western blot 检测下调 Atg9a 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中 Atg9a 表达的影响:AdIGFBPrP1与siAtg9a共转染组Atg9a mRNA及蛋白表达明显低于AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(3)qRT-PCR 及 Western blot 检测下调 Atg9a 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中 LC3B、SQSTM1/p62 表达的影响:AdIGFBPrP1 与 siAtg9a 共转染组 LC3B mRNA 及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 蛋白表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05),SQSTM1/p62 蛋白则高于AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。(4)qRT-PCR 及 Western blot 检测下调 Atg9a 对 AdIGFBPrP1 转染 JS1 中 α-SMA、collagen Ⅰ表达的影响:AdIGFBPrP1与siAtg9a共转染组α-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ 蛋白表达低于 AdIGFBPrP1 组(P<0.05)。结论:体外培养的JS1中,下调Atg9a减少IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达。提示IGFBPrP1可通过正向调控Atg9a促进小鼠HSC自噬,进而促进小鼠HSC活化及ECM表达增多。第四部分 lncRNANEAT1、miR-29b 和 Atg9a 于 IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中的关系探索实验七miR-29b和Atg9a于IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中的关系探索目的:探索miR-29b和Atg9a于IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中的关系。方法:(1)双荧光素酶报告基因实验明确Atg9a是否为miR-29b的靶基因。(2)上调或下调miR-29b,实验分组同实验五。qRT-PCR检测Atg9a mRNA表达;Western blot及细胞免疫荧光检测Atg9a蛋白表达。(3)下调miR-29b同时下调Atg9a,实验分组如下:Control组:正常培养JS1细胞48 h;AdIGFBPrP1 组:AdIGFBPrP1 转染 JS1 细胞48 h;AdIGFBPrP1+miR-29b inhibitors组:miR-29b inhibitors按100 nM转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养 42 h;AdIGFBPrP1+miR-29b inhibitors+siAtg9a 组:miR-29b inhibitors(100 nM)与siAtg9a(50 nM)共转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养 42 h。qRT-PCR检测 LC3B、α-SMA mRNA 表达;Western blot检测 LC3B、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen Ⅰ 蛋白表达。结果:(1)双荧光素酶报告基因检测miR-29b与Atg9a的结合:miR-29b mimics与Atg9a野生型质粒(Atg9a wild type,Atg9a Wt)共转染组相对荧光素酶活性明显低于miR-29b mimics+Atg9a 突变型质粒(Atg9a mutant type,Atg9a Mut)组(P<0.05)。表明Atg9a是miR-29b的靶基因。(2)qRT-PCR、Western blot 及细胞免疫荧光检测miR-29b mimics 或 inhibitors 与AdIGFBPrP1 共同转染 JS1 后 Atg9a 的表达变化:miR-29b mimics 与 AdIGFBPrP1 共转染组较AdIGFBPrP1单独转染组Atg9a mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。miR-29b inhibitors与AdIGFBPrP1共转染组较AdIGFBPrP1单独转染组Atg9a mRNA及蛋白表达升高(P<0.05)。表明miR-29b抑制IGFBPrP1诱导的JS1中Atg9a表达。(3)qRT-PCR 及 Western blot 检测 miR-29b inhibitors 与 siAtg9a 共转染对 AdIGFBPrP1作用的JS1中LC3B、SQSTM1/p62表达的影响:在AdIGFBPrP1作用的JS1中,miR-29b inhibitors 与 siAtg9a 共转染组较 miR-29b inhibitors 组 LC3B mRNA 及 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达降低,SQSTM1/p62蛋白表达升高(P<0.05)。表明miR-29b通过抑制Atg9a抑制IGFBPrP1诱导的JS1自噬。(4)qRT-PCR 及 Western blot 检测 miR-29b inhibitors 与 siAtg9a 共转染对 AdIGFBPrP1作用的JS1中α-SMA、collagen Ⅰ表达的影响:在AdIGFBPrP1作用的JS1中,miR-29b inhibitors 与 siAtg9a 共转染组较 miR-29b inhibitors 单独转染组 α-SMA mRNA 及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达降低(P<0.05)。表明IGFBPrP1通过抑制Atg9a抑制IGFBPrP1诱导的JS1活化及ECM表达增多。结论:体外培养的小鼠HSC中,IGFBPrP1可抑制miR-29b表达,减少miR-29b对Atg9a的直接抑制作用,从而促进Atg9a表达,最终促进小鼠HSC活化及ECM表达增多。实验八 lncRNA NEAT1 和 miR-29b 于 IGFBPrP1 诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中的关系探索目的:探索在IGFBPrP1诱导的JS1自噬及活化、ECM表达中,NEAT1和miR-29b的关系。方法:(1)通过双荧光素酶报告基因实验明确NEAT1是否与miR-29b结合。(2)上调或下调NEAT1,实验分组同实验四。qRT-PCR检测miR-29b RNA的表达。(3)上调NEAT1同时上调miR-29b,实验分组如下:Control组:正常培养JS1细胞48 h;AdIGFBPrP1 组:AdIGFBPrP1 转染 JS1 细胞 48 h;AdIGFBPrP1+NEAT1 组:NEAT1过表达质粒按4 μg/孔转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养 42 h;AdIGFBPrP1+NEAT1+miR-29b mimics 组:NEAT1 过表达质粒(4 μg/孔)与miR-29b mimics(50 nM)共转染JS1细胞6 h后,换含AdIGFBPrP1的培养液继续培养 42 h。qRT-PCR检测 Atg9a、LC3B、α-SMA mRNA 表达;Western blot检测Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen Ⅰ 蛋白表达;细胞免疫荧光检测 Atg9a蛋白表达。结果:(1)双荧光素酶报告基因检测NEAT1与miR-29b的结合:miR-29b mimics与NEAT1野生型质粒(NEAT1 Wt)共转染组相对荧光素酶活性明显低于miR-29b mimics+NEAT1 突变型质粒(NEAT1 Mut)组(P<0.05)。表明 NEAT1 与 miR-29b直接结合。(2)核质分离检测NEAT1的细胞定位:NEAT1在细胞质和细胞核中都有表达。(3)qRT-PCR 检测 NEAT1 或 siNEAT1 与 AdIGFBPrP1 共同转染 JS1 后 miR-29b RNA的表达变化:NEAT1与AdIGFBPrP1共转染组较AdIGFBPrP1组miR-29b RNA表达降低(P<0.05);siNEAT1 与 AdIGFBPrP1 共转染组较 AdIGFBPrP1 组 miR-29b RNA表达升高(P<0.05)。表明NEAT1可抑制IGFBPrP1诱导的JS1中miR-29b表达。(4)qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测 NEAT1与miR-29b mimics共转染对 AdIGFBPrP1 作用的 JS1 中 Atg9a、LC3B、SQSTM1/p62 表达的影响:在 AdIGFBPrP1作用的JS1中,NEAT1与miR-29b mimics共转染组较NEAT1单独转染组Atg9a mRNA及蛋白、LC3B mRNA 及 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 蛋白表达降低(P<0.05),SQSTM1/p62 蛋白表达升高(P<0.05)。表明NEAT1通过抑制miR-29b表达促进IGFBPrP1诱导的JS1自噬。(5)qRT-PCR 和 Western blot 检测 NEAT1 与 miR-29b mimics 共转染对 AdIGFBPrP1作用的JS1中α-SMA、collagen Ⅰ表达的影响:在AdIGFBPrP1作用的JS1中,NEAT1与miR-29b mimics共转染组较NEAT1单独转染组a-SMA mRNA及蛋白、collagen Ⅰ蛋白表达降低(P<0.05)。表明NEAT1通过抑制miR-29b促进IGFBPrP1诱导的JS1活化及ECM表达增多。结论:体外培养的小鼠HSC中,IGFBPrP1可促进NEAT1表达上调,继而抑制miR-29b表达,进一步促进Atg9a表达上调,最终促进小鼠HSC活化及ECM表达增多。全文结论IGFBPrP1可促进小鼠HSC中NEAT1表达上调,NEAT1竞争性结合miR-29b,减少miR-29b对Atg9a的抑制作用,从而上调Atg9a表达,即IGFBPrP1调控NEAT1/miR-29b/Atg9a通路。进一步地,Atg9a调控HSC自噬,并促进HSC活化及ECM增多,最终导致小鼠肝纤维化形成。