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猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的猪的一种以呕吐、水样腹泻为主要特征的接触性传染病,进行TGEV的分子诊断及免疫研究,生产出对猪安全、有效并能迅速产生免疫力的基因工程疫苗为当前研究的主要任务。本研究从猪腹泻病料中分离出了TGEV,进行了血清学鉴定、电镜鉴定和RT-PCR鉴定。并扩增TGEV TS株核衣壳蛋白N基因和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）QH株膜糖蛋白M基因,建立TGEV和PEDV的双重RT-PCR鉴别诊断方法。另外,克隆了TGEV纤突糖蛋白S基因,将其插入pAdTrack-CMV穿梭质粒中,获得了转移质粒pAdTrack-CMV/S,对之线性化后,用pAdEasyTM系统,电转化已转入腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组,构建含有全S基因的重组腺病毒载体pAd/S,后者经酶切充分暴露反向末端重复序列后,与脂质体混合转染AD-293细胞,以获得复制缺陷型重组腺病毒rAd-S。以RT-PCR法检测重组腺病毒rAd-S中TGEV纤突糖蛋白S基因的转录,增强型绿色荧光蛋白（eGFP）荧光检测外源基因的表达,用连续传代和PCR检测rAd-S的稳定性和安全性。为评价重组腺病毒rAd-S对猪的免疫效果,将其灌服或注射28日龄仔猪后,用阻断ELISA检测抗体滴度;60d后进行TGEV强毒攻击,检验其保护力;将所获得抗体与TGEV强毒混合后灌服3日龄乳猪,进一步检测重组腺病毒rAd-S免疫猪后所产生抗体的中和活性;以TGEV强毒攻击灌服重组腺病毒rAd-S免疫母猪的乳汁的3日龄乳猪,检测乳汁免疫对乳猪的保护力。本研究结果如下: 1) 分离了一株TGEV,并通过血清学、电镜鉴定和RT-PCR鉴定,命名为TGEVTS株。 2) 建立了TGEV与PEDV的特异性双重RT-PCR鉴别诊断方法,可直接从腹泻粪样中检测目的基因,为TGEV与PEDV的分子鉴别诊断提供了可行的方法。 3) 克隆的TGEV TS株S基因编码区长度为4350bp,比Purdue株的S基因编码区长6bp,编码1449个氨基酸,与Purdue株核苷酸同源性为98.4%;TGEV TS株N基因长度为1149bp,编码382个氨基酸,与Purdue株核苷酸同源性为98.2%;PEDV QH株M基因长度为681bp,编码226个氨基酸,与CV777株核苷酸同源性为98.5%。 4) 成功构建了含TGEV TS株S基因的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/S、重组腺病毒载体pAd/S和含TGEV TS株S基因的安全、稳定的复制缺陷型重组腺病毒rAd-S。rAd-S毒价高达1×10-9TCID50/0.2mL,RT-PCR检测表明S基因在转录水平有表达:增强型绿色荧光蛋白检测证实,外源基因获得了表达,为TGEV基因工程疫苗的研究奠定了良好的前期工作基础。 5) 重组腺病毒rAd-S表达的S蛋白具有很好的免疫原性,免疫仔猪后产生的特异性抗体具有中和TGEV的活性,与TGEV强毒混合感作后,能抵御TGEV对3日龄乳猪的感染;重组腺病毒rAd-S免疫产前35天的母猪,所产生的乳汁免疫使极敏感的乳猪对TGEV的攻击具有一定的保护力。