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目的:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又称呕吐毒素(vomitoxin, VT),结构上属于单端孢菌烯族毒素,在全世界的粮食和饲料的污染均非常普遍,联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定DON为最危险的自然发生食品污染物之一,并列入国际研究的优先地位。研究表明,DON是我国食管癌高发区居民粮食的主要污染霉菌毒素之一。虽然DON毒性较其它真菌毒素小,但因其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首,同时DON常与其他真菌毒素共存,被食入后可以共同作用于人体,对人类健康造成了很大的威胁。DON具有广泛的细胞毒性,可以抑制大分子的合成,促进免疫细胞凋亡并抑制其增殖,同时抑制或超诱导多种细胞因子的分泌,影响细胞内多种激酶的活性,总体上对机体的免疫功能产生不利的影响。近年来的研究发现,DON可能与人类食管癌、IgA肾病、克山病和大骨节病有关。众所周知,恶性肿瘤的发生除致癌物的直接作用外,机体的免疫状态也发挥着非常重要的作用。HLA-abc分子的正常表达是维持机体抗体抗肿瘤免疫效应的重要化环节。研究表明,许多人类肿瘤中可见HLA-abc分子的失表达和低表达现象。本研究组以往的研究发现,DON可诱导小鼠胸腺细胞和人外周血单个核细胞的凋亡,同时DON抑制外周血单个核细胞抗原提呈分子的表达。因此,认为细胞HLA-abc分子表达降低,可能有助于细胞逃避免疫监视,使癌变发生成为可能。但有关DON对食管鳞状上皮细胞直接作用的研究,国内外尚未见文献报道。本研究运用细胞培养,免疫细胞化学,流式细胞定量检测,Western blot,RT-PCR方法检测了不同剂量DON处理24小时后,原代培养的正常食管鳞状上皮细胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2、ERK和p-ERK蛋白表达变化情况,同时检测了细胞凋亡,探讨分析了DON对正常食管鳞状上皮细胞抗原提呈分子的影响规律和对细胞凋亡的可能影响。从免疫角度探讨DON对机体免疫功能的可能影响,初步揭示DON暴露在我国食管癌高发区肿瘤发生发展中的可能作用。方法:1成人食管鳞状上皮细胞原代培养将取材的正常食管粘膜,在无菌条件下反复冲洗。置于1640培养液中,尽量剪除粘膜下血管和结缔组织,将粘膜剪成2mm2左右的小块。置于涂布胎牛血清的培养瓶中,粘膜面均朝上,加入少量DMEM:F12(1:1)混合培养基,使组织块湿润,在48小时内将瓶中的培养基加到2ml。37℃5%CO2的培养箱培养。以后每2-3天换液一次。21天上皮细胞可布满瓶底。2食管鳞状上皮细胞的鉴定倒置显微镜下观察细胞细胞形态和生长情况,细胞爬片后用广谱CK进行免疫细胞化学染色,鉴定细胞来源。3实验分组与处理当食管上皮细胞晕相互融合,细胞生长铺满大部分瓶底时,随机分为处理组和对照组。处理组加DON(1mg/ml)至终浓度为50、100、1000和2000μg/L。对照组加入等量的生理盐水。作用24h后常规刮匙刮除细胞并离心收集,或细胞爬片后检测各指标表达情况。4细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。5 RT-PCR反转录合成cDNA,建立PCR反应体系,94℃变性5min,94℃5 0s, 56℃3 0s, 72℃3 0s,30次循环扩增,PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳90V 35min。采用凝胶分析软件(BIO-LD)进行定量分析。6细胞总蛋白的提取和定量应用预冷的细胞裂解液加入收集的细胞中,提取细胞总蛋白。将提取的蛋白应用紫外分光光度计进行定量。7蛋白印迹(Western Blotting)经SDS-PAGE电泳、转膜后,ECL发光法显示蛋白,由X线胶片感光将结果记录下来,扫描后再经Bio1D图像分析系统对杂交条带进行定量分析。8免疫细胞化学染色细胞爬片后,采用免疫细胞化学SP法,严格按照操作说明进行,DAB显色,显微镜下观察。9 FCM检测分别收集各组细胞,PBS洗涤,离心收集细胞,一部分用70%乙醇固定检测细胞凋亡情况;另一部分用2%甲醛固定流式细胞定量分析HLA-abc表达情况。10统计分析各项数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,用SNK法进行两两比较,量效关系采用相关回归分析。结果:1原代培养的人正常食管上皮细胞的形态学观察和鉴定DMEM:F12混合培养基中的组织块在5天后有细胞长出。细胞成卵圆形和多角形,胞质透亮,细胞核不清。8-9天可在组织块周围观察到典型的上皮晕,细胞融合后形成上皮细胞典型的“铺路石”样形态。21天上皮细胞可布满瓶底。将组织块迁移到另一培养瓶中,2-3天后可有细胞长出,前后共生长67天。HE染色显示上皮细胞呈卵圆形和多角形,细胞较大,胞质淡染,胞核较大,核位于中央。免疫细胞化学染色显示广谱CK阳性细胞达95%以上。证明培养细胞是食管鳞状上皮细胞。在单独1640培养基中,上皮细胞长出较慢,一般需要7天,细胞轮廓不清,体积较大,老化快,存活时间短,成纤维细胞污染严重。免疫细胞化学染色显示广谱CK阳性细胞只有60%。2 DON对人正常食管鳞状上皮细胞HLA-abc、TAP-1和LMP-2表达的影响2.1 DON对HLA-abc表达的影响RT-PCR检测结果显示:DON 50、100、1000和2000μg/L组HLA-a mRNA相对表达量与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05)。免疫细胞化学染色观察,DON处理组HLA-abc蛋白表达阳性细胞百分数分别为78.75±10.16 %,70.20±11.69 %,46.70±4.55 %和44.85±7.11 %,与对照组(81.90±6.30 %)相比100、1000、2000μg/L组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果, DON处理组(50、100、1000和2000μg/L)的FI值分别为0.98±0.06,0.90±0.09,0.89±0.04,0.94±0.07,与对照组(1.04±0.04)比较,100、1000和2000μg/L处理组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。相关直线回归分析表明, HLA-abc蛋白表达与DON剂量呈负相关关系(r=-0.634,n=3,P<0.05)。2.2 DON对TAP-1表达的影响RT-PCR结果:DON( 50、100、1000和2000μg/L)组TAP-1 mRNA相对表达量与空白对照组相比,差异无统计学意义(P >0.05)。蛋白印迹结果:DON处理组TAP-1的相对表达量均低于空白对照组,其中DON(100、1000、2000μg/L)组TAP-1蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.05)。相关直线回归分析表明,TAP-1蛋白表达与DON剂量呈负相关关系(r=-0.595,n=3,P<0.01)。2.3 DON对LMP-2表达的影响RT-PCR结果: DON 100μg/L处理组LMP-2 mRNA(2.23±0.56)的相对表达量与对照组相比明显升高(P <0.05),其余各组未见明显差异。蛋白印迹结果:DON 100μg/L处理组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),其余各组未见明显差异。3 DON对人正常食管鳞状上皮细胞凋亡及ERK/p-ERK蛋白表达影响3.1 DON对细胞凋亡的影响FCM结果显示, DON (50、100、1000、2000μg/L)处理组的细胞凋亡率分别是6.69±3.57%,9.76±4.52%,14.68±2.26%和19.15±1.72%,与空白对照组(5.29±2.00%)相比,100、1000和2000μg/L处理组凋亡率明显升高(P<0.05)。相关回归分析表明,凋亡率随DON浓度的升高而升高,存在明显的剂量效应关系(r=0.885,n=3,P<0.01)。3.2 DON对ERK和p-ERK蛋白表达的影响蛋白印迹结果:DON对p-ERK和总ERK蛋白表达无影响。结论:1植块法(DMEM:F12(1:1)混合培养基)培养的人正常食管鳞状上皮细胞纯度较高,形态良好,融合后形成上皮细胞典型的“铺路石”样形态。此方法简便易行、成熟稳定,是一种适合推广应用的正常食管上皮细胞培养方法。2相关回归分析表明,在本实验的浓度内,DON可以降低食管鳞状上皮细胞膜上HLA-abc蛋白的表达,但是HLA-a mRNA未见明显变化,提示DON可能是在转录后对HLA-abc的表达产生影响。3相关回归分析表明,在本实验的浓度内,DON抑制食管鳞状上皮细胞TAP-1蛋白的表达,但对TAP-1 mRNA表达无明显影响,提示DON可能是通过影响翻译或翻译后修饰的途径来影响TAP-1蛋白的表达。4 DON(100μg/L)可以明显促进LMP-2 mRNA及蛋白的表达。5 DON对成人正常食管鳞状上皮细胞抗原提呈相关分子影响较为复杂,可能通过转录、翻译或翻译后修饰等多途径发挥作用。6相关回归分析表明,在本实验的浓度内,DON诱导成人食管鳞状上皮细胞凋亡,且随着剂量的升高凋亡率逐渐升高,但不影响磷酸化ERK的表达,提示其诱导细胞凋亡可能是通过其他途径。