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第一部分超声/CT双模态液态氟碳纳米粒造影剂的制备及性能检测目的选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为壳材,液态氟碳全氟辛溴烷(PFOB)为内核,制备PLGA包裹PFOB的双模态纳米粒(PLGA-PFOB NPs)造影剂,检测其基本性质,并通过体外实验探讨其双模态显像能力及生物安全性。方法本部分研究分两节进行。在第一节中,以PEG化端羧基聚乳酸羟基乙酸(PLGA-PEG-COOH)作为外壳,采用双步乳化法制备包裹PFOB的PLGA-PFOB NPs造影剂,并对其外观、粒径、电位、稳定性等性质检测,总结出最佳制备条件。在第二节中,用医用超声诊断仪及螺旋CT检测PLGA-PFOB NPs造影剂不同浓度的体外超声/CT显像能力,与大鼠正常肝细胞孵育,观察对细胞活性的影响;于健康大鼠经尾静脉注射不同浓度的PLGA-PFOB NPs乳液,观察不同时间点(1d、3d、7d、14d)对大鼠肝、肾功能的影响。结果在第一节中,采用双步乳化法成功制备出PLGA-PFOB NPs造影剂混悬液,其外观呈乳白色。光镜及扫描电镜观察示PLGA-PFOB纳米粒呈球形,形态规则,大小尚均匀、分散度好;透射电镜与激光共聚焦下可见PLGA-PFOB纳米粒呈核-壳结构;以每100mg PLGA-PEGCOOH加入PFOB 60μl,双步乳化声振时间大于4min,室温蒸发时间大于6h时能制备粒径较小,性质最稳定的PLGA-PFOB NPs造影剂,粒径大小约255.3nm,表面电位约-16.4m V。在第二节中,体外超声显像,在临床用超声诊断仪高频探头THI模式下PLGA-PFOB NPs造影剂呈高回声,回声强度随浓度增高而升高;在体外CT显像中,PLGA-PFOB NPs造影剂呈高密度,CT值随浓度增高而增加。CCK8法测得PLGAPFOB NPs造影剂在一定的浓度下情况下对细胞活性无明显影响。在选定观察的时间范围内,所用浓度的PLGA-PFOB NPs对大鼠肝、肾功能指标无明显影响。结论成功制备出形态规则,呈球形,大小均匀,性质稳定,生物安全性好的PLGA-PFOB纳米粒造影剂。该造影剂具有良好的声学性能和CT显像能力,具备增强超声/CT显像的潜能,此双模态造影剂在分子显像中有广泛的应用前景。第二部分携带cRGD环八肽靶向超声/CT双模态液态氟碳纳米粒的制备及体外靶向性实验研究目的采用固相法人工合成含有RGD序列的能靶向活化肝星状细胞的环八肽(cRGD,序列为C*GRGDSPC*)以及异硫氰酸荧光素(florescein isothiocyanate,FITC)标记的C*GRGDSPC*-FITC,制备一种新型靶向分子探针---携cRGD肽的靶向双模态显像纳米粒(cRGDPLGA-PFOB NPs),检测基本表征和生物安全性,验证其体外靶向性。方法本部分研究分两节进行。在第一节中,采用叔丁氧羰基(Boc)法固相合成cRGD肽,部分用FITC标记一侧链端,高效液相色谱仪及质谱仪检测其纯度及分子量;运用碳二亚胺法将cRGD肽连接到PLGA-PFOB纳米粒表面,使用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测连接率。在第二节中,体外大鼠肝星状细胞(HSC-T6)并验证其活化状态,用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测cRGD-PLGA-PFOB NPs对HSCs的靶向性;CCK8法检测cRGD-PLGA-PFOB NPs对大鼠正常肝细胞(BRL-3A)活性的影响;于正常健康大鼠经尾静脉注射不同浓度的cRGD-PLGA-PFOB NPs,观察不同时间点(1d、3d、7d、14d)对大鼠14d内肝、肾功能的影响,HE染色观察注射了一定浓度cRGD-PLGAPFOB NPs造影剂30天后大鼠和对照组大鼠的心、肝、脾、肺、肾病理切片情况。结果第一节实验中,合成的cRGD肽和FITC-cRGD肽纯度分别是99.42%和97.6%,分子量分别是792.5和1293.2;制备的cRGDPLGA-PFOB NPs大小均一、分散性好,平均粒径约273.7nm,表面电位约-10.7m V,纳米粒与cRGD肽的结合率为99.73%。在第二节中,经培养传代后,HSC-T6细胞Desmin及α-SMA染色均呈阳性,提示为活化状态的HSCs(a HSCs);流式细胞仪结果显示HSC-T6细胞内cRGD-PLGA-PFOB NPs的荧光强度明显高于PLGA-PFOB NPs,激光共聚焦显微镜显示cRGD-PLGA-PFOB NPs可靶向聚集到HSC-T6细胞内,而BRL-3A细胞内未见明显聚集显像,未携带cRGD的非靶向纳米粒PLGA-PFOB NPs未见向HSC-T6黏附聚集;CCK8法测得cRGDPLGA-PFOB NPs造影剂在一定的浓度下情况下对细胞活性无明显影响。在选定观察的时间范围内,所用浓度的cRGD-PLGA-PFOB NPs对大鼠肝、肾功能指标无明显影响.对照组比较,注射了cRGD-PLGAPFOB NPs 30天后的大鼠心、肝、脾、肺、肾HE染色未见明显异常。结论采用固相法成功合成了cRGD肽和FITC标记的cRGD肽,运用碳二亚胺法能有效地将cRGD肽连接到PLGA-PFOB NPs制备靶向超声/CT双模态液态氟碳纳米粒cRGD-PLGA-PFOB NPs,其具有良好的生物安全性,能有效地靶向活化大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞,为后续体内靶向增强显像实验奠定了基础。第三部分大鼠肝纤维化模型的建立以及整合素αvβ3表达的检测目的建立大鼠肝纤维化模型,对不同程度肝纤维化病理改变进行分析,检测肝纤维化形成过程中与活化肝星状细胞相关的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、整合素αvβ3的表达情况以及与巨噬细胞相关的细胞因子TGF-β1的表达情况,探讨其与肝纤维化程度的相关性。方法通过SD大鼠皮下注射CCl4橄榄油混合液的方法诱导肝纤维化模型的建立,每周2次,分别连续注射3周、6周、9周以建立不同程度肝纤维化模型。对照组皮下注射同等量的生理盐水,每周两次。用HE染色和Masson染色方法观察比较每组的肝脏病理改变、胶原纤维面积百分比。用免疫荧光染色法检测比较各组肝实质内整合素αvβ3和α-SMA的表达,用蛋白免疫印迹法检测比较各组肝脏实质内αv、β3、α-SMA及TGF-β1的表达情况。结果HE染色示纤维化病理改变程度随着诱导时间延长逐渐加重,Masson染色显示随着诱导时间延长胶原纤维面积百分比逐渐增加。免疫荧光染色法显示整合素αvβ3和α-SMA的表达随纤维化程度的加重而逐渐增多,各组间差异具有统计学意义。蛋白免疫印迹检测显示与正常对照组比较,肝纤维化各组的αv、β3、α-SMA、TGF-β1的蛋白表达水平提高,且随着纤维化程度加重而逐渐增加,差异明显。结论成功建立不同程度肝纤维化模型,纤维化肝脏内整合素αvβ3、α-SMA和TGF-β1的表达随着肝纤维化程度的加重而逐渐增加。第四部分超声/CT双模态靶向液态氟碳纳米粒造影剂增强显像与评估肝纤维化实验研究目的观察经尾静脉注射PLGA-PFOB NPs造影剂后48h内增强正常大鼠肝脏超声显像及CT显像的特点,根据超声回声强度值及CT值变化规律选择靶向造影剂增强显像肝纤维化的观察和比较时间点;比较所选时间点cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂对不同程度大鼠肝纤维化的靶向超声显像和CT显像的效果,探讨cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂评估纤维化程度的可行性和原理。方法正常大鼠经尾静脉注射PLGA-PFOB NPs造影剂,利用超声诊断仪器和螺旋CT仪动态观察肝脏增强显像情况并采集图像,分别运用DFY超声图像定量分析软件和CT图像分析软件检测注射前及注射后48h内不同时间点肝脏回声强度值和CT值,观察图像强度变化规律,选择合适cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂增强显像肝纤维化的观察、比较时间点。肝纤维化大鼠各组经尾静脉注射cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂后,动态观察所选时间点纤维化肝脏增强显像情况并采集图像,运用图像分析软件定量分析各组肝脏超声回声强度值和CT值。结果注射PLGA-PFOB NPs造影剂后,超声显像示大鼠体内立刻出现增强显像,增强从前腔静脉开始依次到肝内大血管和肝实质。肝脏回声强度值在注射后5min到达一个峰值,然后持续增强显影6h左右,6h以后EI值明显下降,12h以后回到基线水平;CT显像示与注射前自身对比,注射后5min大鼠肝实质则开始出现增强,并随时间推移而呈持续性增强,CT值在注射后12h达峰值,12h小时后逐渐下降,48h时CT值则明显下降,接近造影前水平;在后续的增强肝纤维化实验中选择注射造影剂后6h为观察比较时间点。注射cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂后6h时,与注射前比较,超声显像示肝脏实质回声增强,纤维化9周组的回声明显强于纤维化3周组和6周组,P<0.05,差异具有统计学意义。纤维化9周组、6周组、3周组肝实质回声明显强于各组注射PLGA-PFOB NPs后,P<0.001,差异具有统计学意义。注射PLGAPFOB NPs后,纤维化9周组的肝实质回声强度强于纤维化6周组、3周组和正常对照组,P<0.05,差异具有统计学意义,肝纤维化6周组、3周组及正常对照组间的回声强度无明显差异。大鼠肝纤维化CT增强显像示注射cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂后6h时,纤维化各组的CT值与对照组比较明显增加了;并且纤维化9周组、6周组及3周组之间的CT值有明显差异,P<0.05。注射cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂后6h时,纤维化各组肝脏CT值均明显高于其注射PLGA-PFOB NPs造影剂后,P<0.05,差异具有统计学意义。结论制备的cRGD-PLGA-PFOB NPs造影剂具有良好的增强肝脏超声/CT双模态显像能力.cRGD-PLGA-PFOB NPs对纤维化大鼠肝脏增强显像强度高于正常大鼠,随着肝纤维化的进展,肝脏回声强度值及CT值也显著增强,各组间差别具有统计学意义。靶向超声/CT双模态纳米粒造影剂分子显像可能成为评估肝纤维化程度的有效方法。