【摘 要】
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犬瘟热(canine distemper, CD )是由犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、热性、高度接触性传染病,是危害特种养殖业发展的一类重要疾病。犬瘟热病毒由7
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犬瘟热(canine distemper, CD )是由犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、热性、高度接触性传染病,是危害特种养殖业发展的一类重要疾病。犬瘟热病毒由7个基因组成,编码六个结构蛋白和一个非结构蛋白(C-蛋白)。其中N基因编码的核衣壳蛋白(N)是CDV的主要结构蛋白,CDV-N蛋白在病毒的装配、转录和复制过程中起重要作用,且N蛋白含有T细胞表位,在细胞免疫方面发挥着重要的作用。因此,开展CDV-N蛋白相关研究,对于犬瘟热的发病机理、免疫机制等方面的研究具有重要的意义。为探索犬瘟热病毒核衣壳蛋白(N)作为诊断抗原的可能性,用PCR方法,从重组质粒pcDNA-N中扩增出N蛋白基因中间保守区,产物经EcoRI和SalI双酶切后克隆到表达载体pGEX-6P-1,并对其进行酶切鉴定和序列分析,结果表明它与已报道的OnderStepoort株核蛋白基因序列基本一致。将构建的重组质粒pGEX-6p-1-N转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG于37℃诱导5h,SDS- PAGE电泳、Western-blotting和IFA检测,证明目的基因获得了有效表达,占菌体总蛋白的14.6%,主要以可溶性蛋白形式存在,且蛋白条带与犬瘟热病毒高免血清呈阳性反应。将表达的融合蛋白作为包被抗原,建立了间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)的诊断方法以检测CDV血清抗体水平。通过测定CDV抗原包被的最佳浓度、血清的最佳稀释度、酶标HRP二抗的最适工作浓度等优化试验,选择间接ELISA最佳的反应条件,试验结果表明,抗原的最佳包被浓度为0.525μg/100μL,最适血清稀释度为1:40,酶标HRP二抗的最适工作浓度为1:2000。本试验进一步建立了间接ELISA的工作程序,并通过批内重复性试验、批间重复性试验、特异性试验等检测手段,表明建立的间接ELISA检测方法具有变异程度较小,具有较好的重复性,且重组核蛋白(GST-N)诊断抗原与常见的犬细小病毒阳性血清、犬副流感病毒阳性血清不发生交叉反应,具有较好的特异性。本实验将病毒核蛋白基因表达产物作为诊断抗原,建立间接ELISA检测方法,为我国进一步进行CDV的诊断和检测及血清学调查提供了一种新的技术手段和方法。
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