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背景目的胶质瘤约占所有原发颅内肿瘤的30-40%,成人胶质瘤中有接近50%是具有侵袭性的胶质母细胞瘤,其恶性程度高,5年生存率低于5%。目前,开展包括手术切除、局部放射和常规化疗等多种方式综合治疗胶质瘤已经取得了一些进展,然而,胶质瘤病人的总体生存率仍然较低,治疗前景不乐观。胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子和信号通路的研究已经在努力探索中,但对其机理知之甚少,对胶质瘤发展有潜在的影响的关键分子的鉴定和识别仍然是重中之重。长链非编码RNAs(LncRNAs)被定义为内源性细胞RNAs,是一类转录本长度超过200nt的RNA分子。最初,lncRNA被认为是RNA聚合酶II转录的副产物,并无生物学功能。然而,近年越来越多的证据表明,lncRNAs参与多种生物过程中的关键调节机制,包括表观遗传、转录和转录后调控。研究发现大量的lncRNAs在肿瘤相关基因调控系统中起着关键作用,它们的表达失调会引起或有助于肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。最近,林等人报道了在三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)中鉴定一个新的长链非编码RNA激活激酶(LINK-A)。LINK-A能激活低氧诱导因子-1α(HIF1α)信号通路,进而促进乳腺癌细胞的糖酵解和肿瘤的发生。但LINK-A是否与胶质瘤恶性生物学行为相关以及可能的分子机制的研究尚未见文献报道。为此,本课题首先研究LINK-A在脑胶质瘤细胞中的恶性生物学功能,进一步阐明LINK-A影响胶质瘤细胞恶性生物学行为的相关分子机制,本研究目的在于明确LINK-A对胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用,从而为脑胶质瘤治疗提供新的理论依据。方法1、RT-qPCR检测正常人星形胶质细胞(HAs)、U87和U251胶质瘤细胞株中LINK-A的表达情况。成功制备出针对LINK-A表达的特异shRNA(shRNA-LINK-A)及阴性对照(shRNA-control)的重组慢病毒载体系统,分别感染胶质瘤U87和U251细胞,用RT-qPCR检测shRNA-LINK-A慢病毒感染后U87和U251细胞中LINK-A的表达情况,验证LINK-A沉默的效率。2、ShRNA-LINK-A感染的U87和U251胶质瘤细胞分为2组:阴性对照组(shRNA-control),实验组(shRNA-LINK-A);用MTT实验检测胶质瘤细胞增殖活力;平板克隆实验检测胶质瘤细胞克隆形成能力。3、ShRNA-LINK-A感染的U87和U251胶质瘤细胞分为2组:阴性对照组(shRNA-control),实验组(shRNA-LINK-A);划痕实验检测胶质瘤细胞迁移能力;Transwell小室实验检测胶质瘤细胞侵袭能力。4、ShRNA-LINK-A感染的U87和U251胶质瘤细胞分为2组:阴性对照组(shRNA-control),实验组(shRNA-LINK-A);采用RT-qPCR实验及Western Blot实验检测阴性对照组(shRNA-control)、实验组(shRNA-LINK-A)中LDH-A的表达情况。5、构建LDH-A过表达质粒,转染U87和U251胶质瘤细胞,实验分为空载体质粒组和LDH-A过表达质粒组,采用实时定量PCR及Western Blot分别检测转染后U87和U251胶质瘤细胞中LDH-A的表达水平,验证LDH-A基因过表达的效率;采用葡萄糖消耗实验检测胶质瘤细胞葡萄糖摄取量情况;乳酸产生实验检测胶质瘤细胞乳酸产生情况;用MTT实验检测胶质瘤细胞增殖活力。6、shRNA-LINK-A和LDH-A过表达质粒共转染U87和U251胶质瘤细胞,实验分四组:阴性对照组(shRNA-control),实验组(shRNA-LINK-A),LDH-A过表达质粒组,shRNA-LINK-A+LDH-A过表达质粒组,采用MTT实验检测胶质瘤细胞增殖活力;平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;Transwell小室实验检测胶质瘤细胞侵袭能力。结果1.长链非编码RNA LINK-A在胶质瘤细胞中高表达。首先采用RT-qPCR检测U87和U251胶质瘤细胞株,以及正常人星形胶质细胞株(HAs)中LINK-A的表达情况。结果发现,与正常人星形胶质细胞相比,U87和U251胶质瘤细胞株中LINK-A的表达明显增高。2.敲减LINK-A抑制胶质瘤细胞的增殖和克隆形成能力。将对照组(control)及LINK-A重组慢病毒载体,即shRNA(shRNA-LINK-A)组及阴性对照(shRNA-control)组分别感染U87和U251胶质瘤细胞株。结果发现,与对照组(control)及阴性对照(shRNA-control)组相比,shRNA(shRNA-LINK-A)组中的LINK-A明显下降。MTT实验结果显示,与阴性对照组相比,敲减胶质瘤细胞内的LINK-A基因后能显著抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖。细胞克隆形成实验结果显示,与阴性对照组相比,敲减胶质瘤细胞内的LINK-A后能显著抑制U87和U251胶质瘤细胞克隆形成能力。3.敲减LINK-A抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭。划痕实验结果显示,与阴性对照组相比,敲减胶质瘤细胞内的LINK-A后能显著抑制U87和U251胶质瘤细胞迁移能力。Transwell小室实验结果显示,与阴性对照组相比,敲减LINK-A基因后能明显抑制U87和U251细胞的侵袭能力。4.敲减LINK-A下调LDH-A的表达。为探索LINK-A在胶质瘤细胞中发挥生物学作用的分子机制,我们检测LINK-A对LDH-A的影响。RT-qPCR结果显示,与阴性对照组相比,敲减LINK-A基因后能显著抑制U87和U251胶质瘤细胞中的LDH-A的mRNA表达。此外,western blot结果显示,与阴性对照组相比,敲低LINK-A显著降低LDH-A蛋白的表达。以上结果提示LDH-A可能参与LINK-A介导的胶质瘤细胞的增殖和侵袭。5.LDH-A促进胶质瘤细胞糖酵解和细胞增殖。为了探究LDH-A基因在胶质瘤中的生物学作用,构建LDH-A空白质粒和LDH-A过表达质粒转染U87和U251胶质瘤细胞株。RT-qPCR和western blot结果显示,与空质粒组比较,LDH-A过表达质粒转染组显著增加LDH-A的mRNA与蛋白水平的表达。葡萄糖消耗实验结果显示,与空质粒组比较,LDH-A过表达质粒转染组显著增加葡萄糖摄取量。乳酸生成实验结果显示,与空质粒组比较,LDH-A过表达质粒转染组显著增加乳酸产生。MTT实验结果显示,与空质粒组比较,LDH-A过表达质粒转染组显著增加细胞的增殖。6.LINK-A通过LDH-A促进胶质瘤细胞生长和侵袭。MTT实验结果显示,与阴性对照组比较,转染shRNA-LINK-A抑制U87和U251胶质瘤细胞增殖,然而,与转染shRNA-LINK-A组比较,共转染shRNA-LINK-A和LDH-A过表达质粒组部分逆转敲减LINK-A介导的胶质瘤细胞的增殖。平板克隆实验结果显示,与阴性对照组比较,敲减LINK-A抑制U87和U251胶质瘤细胞克隆形成能力,过表达LDH-A部分逆转敲减LINK-A介导的胶质瘤细胞克隆形成能力抑制。Transwell小室实验结果发现,与阴性对照组比较,敲减LINK-A抑制U87和U251胶质瘤细胞侵袭能力,过表达LDH-A部分逆转敲减LINK-A介导的胶质瘤细胞侵袭抑制。以上结果提示,长链非编码RNA LINK-A通过LDH-A促进胶质瘤细胞的生长和侵袭。结论在胶质瘤细胞中LINK-A高表达,敲减LINK-A抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步研究发现,敲减LINK-A抑制LDH-A的表达,而过表达LDH-A能促进胶质瘤细胞乳酸生成、葡萄糖摄取以及细胞增殖。此外,LDH-A过表达能部分逆转由LINK-A敲低介导的胶质瘤恶性生物学行为的抑制作用。因此,本研究揭示了LINK-A在胶质瘤细胞中通过LDH-A促进胶质瘤细胞的生长和侵袭,这将为开展胶质瘤的靶向治疗提供了理论依据。