摩帝兜兰胚胎发育及转基因技术研究

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兜兰(Paphiopedilum),是兰科植物中最奇特的属之一,其花形美丽,唇瓣呈兜状,酷似女子的拖鞋,故又被称为“仙履兰”、“拖鞋兰”,其中摩帝兜兰(P.Maudiae)的观赏价值高,市场需求量大,具有较高的经济价值。然而由于其在自然条件下幼年生长期较长,不易恰逢节日开花,市场价值较低,本文旨在通过转基因技术(农杆菌子房注射法、农杆菌介导法、基因枪法)辅以组织培养方法,将调控花期的外源基因建兰的FT(C.ensifolium Flowering Locus T,CeFT)转入摩帝兜兰植株中,以期获得能够提早开花并能调控花期的转基因新品种,不仅能满足消费者需求,而且能通过建立高效的兜兰转基因体系,为其遗传育种研究奠定基础。主要的研究结果如下:  1、摩帝兜兰果实生长动态观察。摩帝兜兰果实形态成熟时间约为150 DAP,5-50 DAP为迅速生长期,果实纵向生长较横向生长明显;50-150 DAP为稳定生长期,果实横向生长更为明显,果实长度基本保持不变;150-180 DAP种子成熟期,种胚发育完成。  2、摩帝兜兰的胚胎发育过程观察。用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察发现,胚囊发育类型为双孢子葱型,45-50 DAP胚囊发育成熟,成熟胚囊具6-8核,胚乳具2核。50-54 DAP时大多数胚囊已完成受精,种胚发育时合子第1次不均衡横裂形成基细胞和顶细胞;基细胞进行有丝分裂发育为具2-4细胞的胚柄,胚柄细胞高度液泡化,到胚胎发育为成熟球形胚后期逐渐退化消失;顶细胞不参与胚柄形成,并且经过有丝分裂最终形成球形胚。种胚自受精形成合子到发育为成熟球形胚约150 DAP,成熟种子仅由外层种皮和球形胚构成,内珠被细胞在胚胎发育过程中被吸收,不具胚乳;败育种子只具外种皮无种胚。  3、农杆菌子房注射法对摩帝兜兰的遗传转化。50 DAP注射果的落果率最大,达66.67%。未注射果的TTC染色率及萌发率最高,分别约为60.61%、36.30%,50 DAP注射果的染色率及萌发率比其它注射时期高,分别约为43.01%、15.21%;二者经相关性分析发现,在p=0.01水平上总体趋势具有一致性,结果呈正相关。最终获得38个(株)抗性PLBs(苗),分别为30、35、42、43、45、48、50、53 DAP的2、7、5、1、3、4、9、7个(株),其中50 DAP的转化率最高,达2.54%,其次是53、48 DAP,分别为2.48%、2.45%。随机挑选4株进行GUS和PCR检测,均显示蓝色并能扩增出预期条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内。利用农杆菌子房注射法转化摩帝兜兰的最佳注射时间为48-53 DAP,证实最佳注射时间为摩帝兜兰的受精时间。  4、农杆菌介导法对摩帝兜兰的遗传转化。含有目的基因(CeFT)的农杆菌经活化并制备浸染液,OD600值为0.6-0.8,浸染摩帝兜兰PLBs,经共培养后除菌,确定抑菌浓度为300 mg/L,再梯度筛选及目的基因检测。GUS染色发现,浸染30min,共培养3、5、7d后均有呈蓝色的PLBs,初步预测有外源目的基因整合到PLBs基因组上;目前该试验仍处在梯度筛选阶段。  5、基因枪法对摩帝兜兰的遗传转化。提取含有目的基因(CeFT)的质粒,DNA浓度为1μg/μl,制备微弹并借助基因枪对摩帝兜兰PLBs进行轰击,经过渡培养10d后,再梯度筛选及目的基因检测,目前该试验仍处在梯度筛选阶段。
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