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由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea，无性态：Pyriculariagrisea)引起的稻瘟病是世界水稻生产上最严重的三大病害之一。培育和利用抗病品种是防治该病害最为经济有效而又环保的措施。然而，由于稻瘟病菌的多样性和易变性，以及缺乏对病原菌与寄主之间互作机制的了解，导致抗病品种感病化的问题日渐突出。研究表明，水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合“基因对基因”学说，即抗性基因与其相对应的无毒基因之间的特异性互作导致了寄主植物表现抗性反应。因此，病原菌无毒基因的克隆及其功能研究对于全面、深入地理解植物与病原菌相互作用的分子机制具有深远的意义。
为了定位和克隆一个新的稻瘟病菌无毒基因AvrPi15，本文主要进行了以下5个方面的研究，结果如下：
1稻瘟病菌全基因组的SSR标记电子物理图谱的构建
根据公共数据库中参考菌株70-15的序列，通过生物信息学(bioinformaticsanalysis，BIA)在稻瘟病菌全基因组的7条染色体上总共开发了121个微卫星标记(simplesequencerepeat，SSR)。然后利用BIA相关软件工具BLAST(http：//www.broad.mit.edu/cgi-bin/annotation/magnaporthe/)将所有的SSR标记锚定在各条染色体的相应的重叠群上，由此构建了稻瘟病菌全基因组的SSR标记电子物理图谱。
2稻瘟病菌无毒基因AvrPi15的遗传分析及初步定位
为了发掘和鉴定一个新的稻瘟病菌无毒基因，作者选择了水稻品种GA25，对2个田间菌株CHL346和CHL42及其杂交后代242个子囊孢子菌株进行了致病性分析。结果表明，242个子囊孢子菌株的非致病与致病反应型符合1∶1的分离比。因此推断，在无毒性菌株CHL346中存在1个无毒基因AvrPi15。
为了快速地确定该无毒基因的染色体位置，利用分离群体分析法(bulked-segregantanalysis，BSA)，从121个SSR标记中，在第6染色体上筛选到了与该无毒基因连锁的6个SSR标记。进一步利用作图群体的242个菌株进行了连锁分析，结果表明，无毒基因AvrPi15位于第6染色体的端粒区域(TEL11)。3稻瘟病菌无毒基因AvrPi15的精细定位及高解析度图谱的构建
为了进一步地精细定位该无毒基因，利用参考菌株70-15的端粒序列，在该区域开发了2个SSR标记和2个STS标记。其中1个SSR标记MS6-17和1个STS标记STS6-6在亲本之间检测到了多态性。然后利用这2个标记对242个子囊孢子菌株进行了连锁分析，结果表明无毒基因AvrPi15被精细定位于STS6-6到端粒重复序列(TTAGGG)n之间0.8cM的区域。为了更加精细地确定该无毒基因的位置，在TEL11的目标区域内开发了2个CAG(candidateavirulencegene)标记。它们在亲本之间都检测到了多态性。经过连锁分析，结果表明，它们均与AvrPi15位点共分离。
为了构建目的基因的物理图谱，利用参考菌株70-15的细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)克隆，通过BIA法构建了该位点的电子物理图谱。结果表明，AvrPi15位点被界定在TEL11大约7.2kb的区域内。
4稻瘟病菌无毒基因AvrPi15的克隆及序列分析
为了确定无毒基因AvrPi15的候选基因，以上述端粒序列为基础，在本研究中以真菌比较基因组学项目(TheComparativeGenomicsofTelomeresinPathogenicandSaprophyticFungi)释放的TEL11的序列为基础，利用2种基因预测注释软件SoftberryFGENESH(http：//www.softberry.com)和GeneScan(http：//genes.mit.edu/GENESCAN.html)，对上述7.2kb进行了基因预测和注释分析，初步确定了无毒基因AvrPi15的候选基因为AvrL3，AvrL4，AvrL5和AvrL6。AvrL5和AvrL6的克隆及遗传转化正在进行中。
对2个亲本菌株的AvrL3和AvrL4分别进行了扩增、克隆和测序，同时2个突变体菌株也用AvrL3和AvrL4的引物分别进行了扩增、克隆和测序。通过BIA，对2个亲本菌株以及2个突变体菌株的序列分别进行了比较分析，结果表明，在AvrL3的基因编码区内发生了单碱基突变，并导致其编码的氨基酸由谷氨酸(G1u)变为甘氨酸(Gly)，在转录起始点的上游启动子区域发生了单碱基缺失。而在AvrL4的基因编码区内发生的单碱基突变并没有引起在氨基酸水平上的变化，在其转录起始点的启动子区域发生了单碱基突变。
5稻瘟病菌无毒基因AvrPi15的遗传转化及功能研究
(1)为了对候选基因的功能进行验证，分别以毒性亲本菌株CHL42，无毒亲本菌株CHL346以及突变体菌株M049，M197为受体菌株，将候选无毒基因及其致病的等位基因进行了遗传转化。通过根癌农杆菌介导的转化体系(Agrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation，ATMT)，获得了一批转化子菌株。通过对转化子菌株进行选择标记潮霉素基因的PCR验证和Southern杂交验证，证实了目的片段已经整合到了受体菌株的基因组中。将含有目的基因的转化子菌株进行接种鉴定，结果表明，AvrL4的转化子菌株实现了功能互补，从而初步确认该候选基因即为目的基因AvrPi15。
(2)为了对该无毒基因进行功能研究，首先对其进行了基因表达分析，根据基因预测的结果，在其外显子区域设计引物，进行了RT-PCR分析。结果表明，AvrPi15为组成型表达的基因。然后，通过3-RACE和5-RACE，获得了该基因的全长cDNA序列，它包括1个外显子(174bp)，5非翻译区(135bp)和3非翻译区(426bp)。
(3)根据无毒和有毒亲本菌株的cDNA序列以及突变体M049和M197的DNA序列比对的结果，发现该无毒基因在其编码区内发生的单碱基突变并没有引起氨基酸的变化。同时，作者还发现其变化主要集中在3非翻译区。另一方面，作者根据该基因编码的氨基酸序列，通过BIA获知，该无毒基因与端粒连锁的解旋酶基因的部分序列具有高度同源性，而且该基因编码的第39-44个氨基酸为核输出信号(NES)。