论文部分内容阅读
目的:从人外周血中获得imDC,与同种异体CD4+T细胞混合培养,运用ERK1/2信号通路特异性阻断剂U0126阻断该通路,研究其在imDC诱导同种异体CD4+T细胞分化为Treg细胞中的作用,探讨免疫耐受状态建立的可能分子机制。方法:取一名健康成人肘静脉血50ml,密度梯度离心法从血液标本中分离PBMC,将分离的PBMC培养2h,加入GM-CSF和IL-4联合诱导、扩增至第7天,使其转化为imDC,从细胞形态学、细胞表面标记物以及细胞功能三方面进行鉴定。同法取一新生胎儿脐静脉血50ml,从中分离单个核细胞,免疫磁珠分选法从单个核细胞中分离初始性CD4+T细胞,将其均分为5组细胞培养,并分别作以下处理:(1)、空白组:脐静脉血CD4+T细胞培养液中加入等量的U0126稀释液和imDC稀释液单独培养;(2)、混合对照组:imDC与脐静脉血CD4+T细胞以1:10的浓度比混合培养,细胞培养液中加入等量的U0126稀释液;(3)、低浓度U0126组:imDC与脐静脉血CD4+T细胞以1:10的浓度比混合培养,细胞培养液中同时加入终浓度为10μmol/L的U0126;(4)、中浓度U0126组:imDC与脐静脉血CD4+T细胞以1:10的浓度比混合培养,细胞培养液中同时加入终浓度为30μmol/L的U0126;(5)、高浓度U0126组:imDC与脐静脉血CD4+T细胞以1:10的浓度比混合培养,细胞培养液中同时加入终浓度为50μmol/L的U0126。混合培养5天后,以FCM检测初始性CD4+T细胞转化为Treg细胞的转化率。结果:(1)imDC的鉴定:在形态学方面,培养至第7天的单个核细胞悬浮生长,表面可见毛刺状突起,体积较前增大。(2)FCM检测Treg细胞的转化率:imDC与CD4+T细胞混合培养后, FCM检测初始性CD4+T细胞转化为Treg细胞的转化率,其结果如下:空白组:3.25士0.89,混合对照组:21.80士0.40,低浓度U0126组:22.58士0.52,中浓度U0126组40.81士0.81,高浓度U0126组:41.58士0.81。经单因素方差分析,混合对照组和低浓度U0126组之间无显著性差异,P值>0.05,中浓度U0126组和高浓度U0126组之间也无显著性差异,P值>0.05,其余各组之间两两比较均有显著性差异,P值<0.05。结果表明:当U0126的浓度为30μmol/l时对该通路的阻断作用显著,当继续加大其浓度时Treg细胞转化率增加不明显,而当小于该浓度时其转化率与混合对照组的转化率无显著性差异。结语:(1)通过应用rhGM-CSF+rhIL-4联合诱导PBMC可获得imDC,建立了一种稳定且高效的imDC的体外培养方法。(2)人外周血来源的imDC可以诱导初始性CD4+T细胞转化成Treg细胞。(3)ERK1/2信号传导通路特异性阻断剂U0126可以部分促进初始性CD4+T细胞向Treg细胞转化,表明该阻断剂在免疫耐受的诱导中起了较为重要的作用。